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线虫保存技术研究进展
本文较系统地阐述了有关线虫保存方法的研究进展,对实验室传统保存方法和近年发展的深低温保存和脱水保存的原理和生理生化机制作了简要概述,并比较了各种方法的优劣,对未来线虫商业化生产过程中保存方法的发展予以展望.
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逆转录-聚合酶链反应检测蚊标本乙型脑炎病毒核酸片段
蚊子是乙脑病毒的传播媒介,蚊子带毒率的调查是监测自然界乙脑流行的主要手段之一.一般用常规的生物学方法分离病毒了解蚊带毒率情况,该方法工作量大,出结果慢,费时费力.本研究试图用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测蚊标本乙脑病毒核酸片段,并与常规分离病毒方法进行比较.1997年夏季从辽宁、沈阳、长春等地采集蚊标本约1 100余只,液氮保存.将蚊标本20～30只混合为一组,常规消毒、研磨、离心后,将上清分为两份,一份接种C6/36和BHK-21,连传3代,观察细胞病变,另一份作RT-PCR检测.
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同种异体带瓣大动脉的术中复温处理
同种异体带瓣大动脉(以下简称同种瓣)在复杂的先天性心脏病的外科治疗中用途广泛,前景广阔,是目前建立右心室到肺动脉的连接,主、肺动脉置换,Fontan类手术的腔静脉与肺动脉连接较为理想的修复材料.[1-3]1987年10月至2001年12月,我院自行取材制备,并用液氮保存具有活性的同种瓣,行右心系统外通道治疗复杂先天性心脏病810例,使用效果满意.同种瓣在术中的复温处理是手术成功的重要前提条件,而目前又缺少有关同种瓣复温处理的详细操作方法.[4～7]为此,总结810例同种瓣的术中复温处理方法,现介绍如下.
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结石性胆囊炎及胆囊腺瘤性息肉黏膜组织MUC1粘蛋白的检测
目的:检测胆囊息肉、胆固醇结石、胆红素结石时胆囊黏膜MUC1粘蛋白的(半)定量表达及规律.方法:采用Western-blot法:称取液氮保存胆囊黏膜组织100--200mg加入组织裂解液lml匀浆、离心、去上清、分装、测蛋白含量、电泳、电转移、杂交、化学发光试剂检测.结果:ODu结果分别为34.29±6.06(对照组),142.11±38.49(胆红素结石组),39.72±11.46(胆固醇结石组),174.59±41.6(胆囊息肉组).结论:对照组胆囊、结石性胆囊及腺瘤性息肉胆囊有MUC1粘蛋白的表达,且表达量逐渐增高.正常胆囊-结石性胆囊炎-胆囊息肉MUC1粘蛋白的表达是上调表达;用Western-Blot可以较好地检测各种胆囊组织黏膜MUCl粘蛋白的对比含量和带形分布,不同疾病粘蛋白含量不同,带形分布不一样,相同疾病标本粘蛋白含量也不尽相同.
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在单磷酰脂A预处理过程中心肌环氧化酶-2表达的作用
1材料与方法随机选取健康雄性Wistar大鼠,体重(250±30)g,由同济医科大学动物中心提供,以20%乌拉坦(1g/kg)麻醉,实验分4组:(1)对照(NC)组.(2)单纯缺血再灌注(I/R)组.(3)单磷酰脂(MLA)预处理(MLA-DP)组:于I/R前24h由舌静脉滴入MLA(450μg/kg).(4)NS-398组:先同MLA-DP组应用药物,再于第2天I/R前35min应用COX-2抑制剂NS-398(5mg/kg),在相同时点不用药物组,则用等量生理盐水作为平衡对照.各组6只动物于再灌注120 min后双重染色心肌,用IBAS全自动处理系统计算各部面积,并计算出心肌梗死面积.每组用药前及手术后分别取静脉血测定血浆乳酸脱氢酶(LDH)活性.将MLA-DP、NS-398组的另一批动物于预处理后24 h(I/R组前)处死,同时处死另一批正常动物.快速取各组处死动物的心脏左室前壁心肌,一部分液氮保存,用于提取所取心肌中的总蛋白,另一部分用于提取前列腺素类化合物.从每组标本蛋白质样品中取20μg,凝胶电泳分离-转膜-封闭-加入兔抗环氧化酶-2(COX-2)的单克隆抗体-再加入辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG抗体-后加入ECL试剂-曝光.将Westem blot条带进行密度扫描.每组COX-2表达量以NC组积分光密度的百分率表示.提取前列腺素类化合物,使用前列环素E2(PGE2)作为内参.使用PGE2,6酮-前列腺素F1α(6-K-PGF1α)相应的EIA试剂盒检测两者的量.实验数据以x±s表示,两组间比较用单因素方差分析.
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常温充氧晶体和氧合血停搏液持续灌注对心肌能量代谢的影响
我们从能量代谢角度探讨常温体外循环(CPB)时,常温充氧晶体和氧合血停搏液持续灌注的心肌保护效果,报告如下.方法健康犬15条,随机均分3组,建立体外循环主动脉根部连接灌注装置后,对照组在低温CPB下灌注4℃ St.Thomas液(钾浓度16mmol/L)10ml/kg,20分钟复灌一次;温血组和温晶组参照Menasche方法[1]并加以改进,先快速推入10ml高钾液(K+=8mmol/10ml),继以常温(37℃)中度稀释的机内氧合血[PO2:300～401mm Hg(1mm Hg=0.133kPa)]或常温充氧低钾St.Thomas液(K+=4mmol/L,PO2 360～420mm Hg)每分钟2ml/kg,另管并行滴注上述高钾液每分钟0.5ml.循环共阻断60分钟.于阻断前、阻断15、50分钟、开放20分钟4个时点取心尖部心肌组织立即置于液氮保存,备测定各项指标用.
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液氮保存微小隐孢子虫卵囊对小鼠感染力的研究
目的 观察两种不同保存方法 对微小隐孢子虫卵囊感染小鼠能力的影响.方法 用PBS稀释纯化的卵囊,加入二甲基亚砜(DMSO),置-40℃ 3h后,放入液氮中保存;或加入2.5%重铬酸钾中,4℃保存.3个月后取出,观察它们的脱囊率;分别感染用地塞米松免疫抑制后的BALB/c小鼠,计数卵囊排出量,计算平均每克粪便中的卵囊数目,同时记录两组小鼠的死亡时间.分别采用t检验和成组设计的两样本秩和检验进行统计学分析.结果液氮中保存3个月的卵囊能够感染免疫抑制的BALB/c小鼠,其脱囊率为7.2%～49.6%、卵囊排出量为(4.7～7.3)×10~5/g,接种后实验小鼠死亡时间为124～351 h,与4℃保存的卵囊差别无统计学意义[8.3%～51.2%,(4.6～6.9)×10~5/g,132～348 h,P均>0.05)].结论 液氮中保存3个月的卵囊与4℃保存的卵囊对免疫抑制的小鼠具有同样的感染力,突破了微小隐孢子虫卵囊只能在4℃保存的传统观念,为隐孢子虫卵囊的长期保存提供了理论和实践依据.
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自体外周血干细胞采集和冷冻保存与移植后造血功能恢复的研究
自体外周血干细胞移植(APBSCT)具有造血及免疫重建快、瘤细胞污染少等优点,正被临床广泛应用.干细胞的采集和冷冻保存是移植成功的关键,只有采集到足够数量的造血干细胞并进行适当有效的冷冻保存,回输后才能获得造血重建.本科1996年12月～1998年10月,对14例恶性血液病患者进行APBSCT,造血干细胞通过程控冷冻,液氮保存,回输后全部患者造血功能得到重建,现报告如下.
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海南部分地区不明热患者斑点热立克次体血清学和病原学调查
斑点热是由斑点热群立克次体引起的蜱媒传染病。近年来调研资料表明，海南岛存在该病的自然疫源地[1,2]。由于该病多无特征性临床病征，临床上易误诊为不明原因发热。为了解海南岛斑点热的流行病学特征，探明“不明热”的病因，我们在1998年4～8月间在海南琼中、三亚等收集了诊为不明原因发热的患者血液81份，应用PCR/RFLP方法检测斑点群立克次体特异性核酸，结果报告如下。1 材料与方法1.1 标本的采集 1998年4～8月间，在海南琼中大丰农场、新进农场及长征农场职工医院及三亚市人民医院收取诊为不明热的血液标本81份，液氮保存。
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液氮保存对人同种主动脉瓣形态结构的影响
本研究旨在探讨同种主动脉瓣瓣膜形态结构与冷冻保存时间的相关性,现将结果报道如下.一、材料与方法1.材料:选用18～35岁健康成年男性脑死亡30 min内取材的主动脉瓣20个.实验分为新鲜对照组(Ⅰ组)和冷冻保存组(Ⅱ～Ⅹ组),冷冻保存组依据在液氮(-196 ℃)中保存时间分为Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ组,分别为冷冻保存1、3、6、9、12、15、18、21、24个月的瓣膜,每组2个瓣膜共6只瓣叶.2.冷冻保存及复温:修剪备用的带瓣主动脉管道浸入含二甲基亚砜(DMSO)的营养液中,无菌薄膜3层分别束扎,置入4 ℃冰箱中2 h,再置入液氮蒸汽中使瓣膜缓慢降温,后入液氮中保存,降温速率保持在1 ℃/min左右.定期添加液氮,使瓣膜始终保持在-196 ℃.取保存不同时间的带瓣管道在37 ℃水中快速复温5 min,然后掀去包裹薄膜,在37 ℃无菌生理盐水中快速复温.复温过程中不断轻柔翻动带瓣管道,使带瓣管道的各部位温度均匀上升.
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应用RNA保护分析法观察原发性肝内胆管结石患者肝细胞内葡萄糖醛酸转移酶基因的表达
本实验旨在观察肝细胞内影响胆红素代谢的酶--葡萄糖醛酸转移酶(UDP-GT1)活性和基因表达的变化在原发性肝内胆管结石(PIS)中的作用，现将结果报道如下。 一、对象与方法 1.病例选择和标本收集：以术中肝内胆管有褐色易碎结石定为PIS，收集我院1995年1月～1997年12月此类病人36例为患者组，其中男20例，女16例。术中取病变肝叶肝组织液氮保存。收集其他手术患者肝活检标本7例作为正常对照组，其中胆囊息肉患者4例，胃癌3例，肝功能化验均正常，术中取肝活检组织液氮保存，胆汁送细菌培养。 2.肝组织UDP-GT1活性测定：按照Burchell法［1］测定UDP-GT1活性。取正常组病人UDP-GT1均数的1/2值定为UDP-GT1活性异常降低界限。两组病人UDP-GT1 活性降低的人数以百分比表示，进行t检验。参照物的设定：测定肝组织匀浆内葡萄糖-6-磷酸酶活性，以排除因取样或样品保存等因素造成UDP-GT1活性的非特异性改变。 3.UDP-GT1 mRNA表达量的检测：(1)RNA保护分析法：以β-G lobin基因为内参照测定UDP-GT1 mRNA表达量。合成两个寡核苷酸探针，用32P标记：①UDP -GT1探针，5’-CCTGGGCACGTAGGAGAATG-3’(antisense,590～620 bp，针对UDP-GT 1特有的第5个外显子)；②β-Globin探针，5’-ACCACCAACTTCATCC-ACGTTCACC-3’(antisense,64 440～62 266 bp)。杂交方法：异硫氰酸胍提取肝细胞总RN A，取10 μg RNA，同一管中加入同位素标记的UDP-GT1和β-Globin两种探针，液相杂交后加RnaseS1消化掉未杂交上的RNA，聚丙酰胺变性胶电泳，放射自显影，切下放射性条带用2C-201型放射测量仪，测定放射线计数。UDP-GT1 mRNA丰度的判定以β-Globin为内对照，所测UDP-GT1放射线计数与β-Globin放射线计数之比为该基因的相对丰度。(2) 斑点杂交：探针制备：UDP-GT1质粒(荷兰Bosma教授惠赠)扩增后利用EcorR1酶切，切下的一段700 bp片段，用地高辛标记及杂交试剂盒(Boehringer Mannheim公司)进行标记和杂交。斑点杂交：分别取每个样品总RNA 5、10、15 μg点于硝酸纤维素膜，进行斑点杂交。U DP-GT1 mRNA表达量的判定以薄层扫描仪对显色的蓝色斑点进行扫描(580 nm波长)，计算出每个样品3个斑点的平均波峰面积，以样本总RNA量为单位，比较各组平均波峰面积。 二、结果 1.肝组织保存质量：正常组肝组织葡萄糖-6-磷酸酶的活性正常，患者组有8例降低，该8例病人不纳入实验结果统计，以排除因取样或样本保存不当所造成的实验误差。患者组实际纳入统计的病人只有28例。
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小儿液氮保存自体颅骨成形七例报告
我院1997年1月～2000年12月进行液氮深低温保存自体颅骨成形113例, 其中年龄小于12岁患儿7例, 占6.19%, 报告如下.
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OPH对缺血-再灌注损伤心肌能量代谢的影响
目的:OPH是本研究所合成的创新化合物,对心血管系统有明显活性.以往的研究显示它对冠脉阻断-再灌或全心停灌-复灌所致心肌损伤有明显保护作用,为探讨其作用的生化机制,研究OPH对再灌注心肌能量代谢的影响.方法:大鼠Langendorff氏心脏,K-H液灌流100 min作为正常对照组;平衡30 min后,停灌40 min-复灌30 min作为再灌注损伤组;给药组于停灌前5 min至停灌前及复灌期灌注含OPH的K-H液.取复灌30 min时的心脏,液氮保存,用酶学法测心室肌ATP,PCr与Pi含量.结果:停灌-复灌致心肌ATP从缺血前的41±19下降到17±5 (μmol/g) (P＜0.001),PCr从127±15下降到58±27 (μmol/g)(P＜0.001). OPH 1～10 μmol/L剂量依赖性地对抗上述反应.当浓度为10 μmol/L时,心肌ATP与PCr含量保持在正常水平.停灌-复灌未见心肌Pi含量有明显变化,OPH对Pi含量亦无影响.然而OPH3与10 μmol/L使ATP/Pi与PCr/Pi恢复到正常水平.结论:OPH有减少心肌高能磷酸化物分解,保持损伤心肌能量储备的作用.
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bcl-2在鸡马立克氏病肿瘤中的表达
目的:从mRNA水平测定bcl-2在鸡马立克氏病MD肿瘤中的表达,阐明bcl-2与MD淋巴瘤形成的关系.方法:用来克亨SPF鸡复制MD肿瘤模型,取肿瘤和相应正常组织,液氮保存,用AGPC(Acid Guanidiniun Thiocyanate-Phenol-Chloroform,一步法)法提取组织总RNA(TRNA),紫外测定其浓度,甲醛变性胶电泳观测其纯度.一个含鸡bcl-2 1.2 kb片段的质粒(pTTCB1),经转化扩增,提取质粒DNA,并用限制性内切酶(RE)消化,回收纯化bcl-2片段,放射性[α-32P]标记,制成探针,通过班点(Dot blot杂交和Northern blot分子杂交检测MD肿瘤组织中的bcl-2的表达情况,并与相应的正常组织比较.结果:①MD肿瘤组织和相应正常组织中均有bcl-2的表达;②MD肿瘤组织中bcl-2 mRNA的水平明显高于相应的正常组织.结论:bcl-2表达产物通过阻遏细胞凋亡促进MD淋巴瘤的形成.
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影响人胚胎脑组织冷藏因素的研究
人胎脑组织的良好保存是临床上中枢神经系统疾病或损伤的患者获得脑组织移植的根本保证.本人从事神经细胞冷藏技术多年,曾对人胎脑神经细胞的冷藏保存进行了系列研究.我们对人胎脑组织在4℃冰箱和-196℃液氮内保存、脑组织块与脑细胞悬液冷藏和人胎脑组织与大鼠胎脑组织冷藏后的活细胞成活率进行了比较,并对冷藏时合理控制温度下降速度进行了探索.收集2hr内水囊引产8～16W的人胚胎,在无菌条件下取大脑皮质或黑质,入不含钙镁的PBS中.将脑组织剪碎(脑组织块冷藏组被剪成2mm3小组织直接入MEM培养液)过200目尼龙网制成悬液,离心去上清后加入EME培养液并分装数管.取一管进行台盼蓝染色做细胞总数计数、活细胞及死亡细胞计数,为冷藏前对照.其余分别放入4℃冰箱保存和-196℃液氮内保存(先4℃ 10min,再入-20℃ 10min,然后再投入液氮中).这样可以合理的控制温度的下降速度,从而减少快速冷冻对细胞的损伤.结果表明,4℃冰箱保存组1～5d的细胞成活率明显高于液氮保存组.但5d后4℃冰箱保存组的细胞逐渐死亡,而液氮保存组细胞成活率并不随保存时间的延长而明显改变.因此 ,需要长期保存的脑组织以液氮冷藏为宜,而短期内将用于科研和临床的脑组织好采用4 ℃冰箱保存.我们在实验中发现,以脑组织块的形式放入培养液进行液氮冷藏,复苏后制成悬液在镜下观察,其细胞成活率高于悬液保存组,且细胞形态与冷冻前接近.其机制有待进一步探讨.冷藏前我们还对加有10%的二甲基亚砜的细胞悬液与未加组的细胞悬液进行了观察比较, 发现前者的细胞成活率略低于后者.我们认为二甲基亚砜对细胞可能有一定的毒性作用.我们还发现在同样条件下,大鼠脑组织冷藏后的细胞成活率高于人的脑组织细胞成活率.说明人的脑组织冷藏要求条件高、难度大.我们采用所掌握的冷藏技术已成功地将人胚胎黑质细胞移植到了大鼠帕金森氏病动物模型的脑中,并获得了预期的结果.
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无细胞百日咳攻击菌的制备及液氮保存方法分析
为了制备无细胞百日咳效价测定用攻击菌并用液氮进行保存,对此方法进行评价.采用原代攻击菌复苏传代后测定细菌浓度,并用蛋白胨水稀释为27亿个菌/ml,分装冻存管中.放入液氮罐内,并对液氮保存的攻击菌进行相应的检测,用统计软件计算.结果显示,此方法制备的攻击菌与传统的攻击菌无显著性差异,冻后虽攻击菌的毒力有所下降,但都在100～1000/MLD的正常范围内,且冻后0、3、6、9、12月无显著性差异.同批支间差异小,CV＜ 5% .通过此方法制备的攻击菌稳定性好,试验结果符合<中华人民共和国药典>要求,可用于无细胞百日咳的效价测定.
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程控降温后液氮保存对自体外周血造血干细胞含量和活性的影响
目的:观察程控降温后液氮保存对自体外周血干细胞含量和活性的影响.方法:13例接受APBSCT患者分离的造血干细胞利用程控降温仪进行冷冻,然后置液氮液相内(-196℃)保存,检测患者冻存前后的有核细胞数,CFU-GM,CD34+细胞.结果:冻存前后CFU-GM,有核细胞数,CD34+细胞统计学之间无显著性差异.结论:自体外周血干细胞体外冷冻处理和保存是有效和适当的.
