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新生大鼠神经干细胞球体外生长传代及分化鉴定
近年来,有关神经干细胞分离培养和研究已经成为神经生物学研究的热点.已有许多研究小组报道了大鼠、小鼠和人胚胎脑组织神经干细胞的分离和培养方法[1-3],但对新生大鼠的脑组织神经干细胞进行分离传代培养则鲜有报道.由于神经干细胞可作为一种移植手段治疗神经系统各种病变和损伤,还可用于研究不同生长因子对神经干细胞的体外发育的影响,其有着广泛的应用前景.因此,我们实验室利用新生当天大鼠大脑皮质和中脑进行神经干细胞的分离培养取得成功,现报道如下.
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对从文库中钓取的未知序列进行初步分析的方法
从文库中钓取特定基因时, 常常会克隆到一些未知的DNA序列.这些序列很可能是未知蛋白质的编码基因,因此,对这些基因的分析很可能是发现某些新蛋白质的契机.本文作者在从人胚胎脑组织cDNA文库中钓取FGF-17的过程中,利用FGF-17的引物,经RT-PCR获得了一段DNA序列,利用BLAST与美国国立卫生研究所基因序列数据库GenBank中的序列进行比较,发现这是一个未见报道的序列.本文中以这个序列为例,讨论一下如何对一段未知序列进行初步分析.
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胚胎脑组织制备(磁场+冷冻处理)脊髓移植试验观察
目的探讨脊髓损伤后,组织移植的可行性.方法同种动物胚胎脑组织,为增强生理活性磁场处理.保存在低温环境中、后移植异体脊髓中.结果移植后的组织成活部分功能恢复.
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影响人胚胎脑组织冷藏因素的研究
人胎脑组织的良好保存是临床上中枢神经系统疾病或损伤的患者获得脑组织移植的根本保证.本人从事神经细胞冷藏技术多年,曾对人胎脑神经细胞的冷藏保存进行了系列研究.我们对人胎脑组织在4℃冰箱和-196℃液氮内保存、脑组织块与脑细胞悬液冷藏和人胎脑组织与大鼠胎脑组织冷藏后的活细胞成活率进行了比较,并对冷藏时合理控制温度下降速度进行了探索.收集2hr内水囊引产8～16W的人胚胎,在无菌条件下取大脑皮质或黑质,入不含钙镁的PBS中.将脑组织剪碎(脑组织块冷藏组被剪成2mm3小组织直接入MEM培养液)过200目尼龙网制成悬液,离心去上清后加入EME培养液并分装数管.取一管进行台盼蓝染色做细胞总数计数、活细胞及死亡细胞计数,为冷藏前对照.其余分别放入4℃冰箱保存和-196℃液氮内保存(先4℃ 10min,再入-20℃ 10min,然后再投入液氮中).这样可以合理的控制温度的下降速度,从而减少快速冷冻对细胞的损伤.结果表明,4℃冰箱保存组1～5d的细胞成活率明显高于液氮保存组.但5d后4℃冰箱保存组的细胞逐渐死亡,而液氮保存组细胞成活率并不随保存时间的延长而明显改变.因此 ,需要长期保存的脑组织以液氮冷藏为宜,而短期内将用于科研和临床的脑组织好采用4 ℃冰箱保存.我们在实验中发现,以脑组织块的形式放入培养液进行液氮冷藏,复苏后制成悬液在镜下观察,其细胞成活率高于悬液保存组,且细胞形态与冷冻前接近.其机制有待进一步探讨.冷藏前我们还对加有10%的二甲基亚砜的细胞悬液与未加组的细胞悬液进行了观察比较, 发现前者的细胞成活率略低于后者.我们认为二甲基亚砜对细胞可能有一定的毒性作用.我们还发现在同样条件下,大鼠脑组织冷藏后的细胞成活率高于人的脑组织细胞成活率.说明人的脑组织冷藏要求条件高、难度大.我们采用所掌握的冷藏技术已成功地将人胚胎黑质细胞移植到了大鼠帕金森氏病动物模型的脑中,并获得了预期的结果.
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脑内组织移植研究及临床应用现状
脑内组织移植的研究已有一个多世纪的历史.早在1890年,Thompson就在纽约医学杂志上发表了题为"成功的脑移植"的报告;Saltykow1905年在行幼兔大脑皮层移植时发现移植物存活8天;Del Conte1907首次试图将哺乳动物兔胚胎脑组织做成年动物脑内移植物,但这些报告都未能证明脑组织移植物能够长期存活,甚至得出了脑是不适合移植的器官的结论.
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小鼠胚胎脑组织移植块中选择性荧光标记神经元的发育和投射
目的:建立选择性荧光标记小鼠胚胎脑组织移植块移植模型并观察选择性荧光标记的神经元在成体脑组织中的存活、发育和投射.方法:将孕龄14 ～ 15 d选择性荧光标记的胎鼠脑组织块移植到受损的普通小鼠大脑皮层中,2个月后用荧光显微镜和共聚焦显微镜结合Nissl染色的方法观察胚胎脑组织移植块内选择性荧光标记的神经元在受体大脑中的生长发育情况.结果:在胚胎脑组织移植块内观察到只有少部分神经元被标记,这些类似于Golgi染色模式的选择性荧光标记的神经元有大量的神经纤维投射到受体鼠的不同脑区.通过Nissl染色和共聚焦成像发现胚胎脑组织移植块内神经元能分化并形成典型的突触结构-树突棘和突触终扣.结论:胚胎脑组织移植块内选择性荧光标记的神经元在受体脑内能够存活并特异性地表达荧光,这些标记的神经元具有正常的形态结构,可以投射到各个脑区并参与神经回路的重建.
