Objective Transforming growth factor-β1 (TGF-β1)can activate mitogen-activated protein kinases (MAPKs) in many types of cells.

肾复康对肾纤维化模型大鼠转化生长因子-β1、Smad2、Smad7表达的影响

目的:评价肾复康对纤维化模型大鼠的疗效和对肾组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad2、Smad7表达的影响.方法:选取SD大鼠70只,完全随机分为假手术组、肾复康组及模型组,其中肾复康组及模型组均接受肾间质纤维模型制备,将造模第2天肾复康组接受不同剂量肾复康灌胃,对照组及假手术组接受同等体积的生理盐水灌胃,均干预21 d.干预结束收集各组24 h尿液,检测24 h尿蛋白(24 UP)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)水平的变化,并断头取材,用苏木精-伊红(HE)染色评价各组肾组织的病理变化,免疫组化法检测各组肾组织TGF-β1的变化,用Western blotting法检测Smad2、Smad7水平.结果:与假手术组比较,肾复康组及模型组24 UP、SCr及BUN水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,肾复康组24 UP、SCr及BUN水平有所下降,差异有统计学意义(P<0.05),且随着肾复康剂量升高趋势更明显.与假手术组比较,肾复康组及对模型组肾组织病理学评分均明显升高,其中肾复康组评分低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).随着肾复康剂量的增加病理学评分逐渐下降;假手术组肾组织仅有少量TGF-β1、Smad2表达,模型组Smad2、TGF-β1呈高表达,随着肾复康剂量的增加Smad2、TGF-β1水平逐渐下降.造模后Smad7水平下降,肾复康干预后Smad7水平有所上调,并随着水平的增加而上调趋势更明显.结论:肾复康可明显改善肾间质纤维化模型大鼠病情,其作用机制可能与介导肾脏组织TGF-β1、Smad2、Smad7有关,且具有剂量依赖性

益肾化瘀方含药血清对NRK52E细胞转分化过程中p-Smad2/3、Smad7表达的影响

目的:观察益肾化瘀方含药血清对TGF-β1诱导的体外培养的肾小管上皮细胞(NRK52E)转分化过程中p-Smad2/3、Smad7表达的影响.方法:将体外培养的NRK52E细胞随机分为6组:正常对照组,TGF-β1刺激组,5％、10％、20％益肾化瘀方含药血清组,缬沙坦含药血清组,培养48h后取出.观察各组细胞形态变化,采用免疫细胞化学法检测NRK52E细胞p-Smad2/3、Smad7的表达.结果:NRK52E细胞经TGF-β1刺激后,失去原有的铺路石样形态,拉长增大呈梭形,而与益肾化瘀方含药血清共同作用后,细胞形态有所修复,细胞梭形改变减轻;免疫组化显示与正常对照组比较,TGF-β 1刺激组细胞p-Smad2/3核表达明显增强(P＜0.01),Smad7表达却减弱(P＜0.01).而各药物干预组与单纯TGF-β1刺激组相比,p-Smad2/3的表达随药物浓度增加呈下降趋势(P＜0.01),而Smad7表达的阳性率明显增强(P＜0.01).其中20％益肾化瘀方含药血清组与缬沙坦含药血清组的表达无显著差异.结论:益肾化瘀方含药血清通过抑制Smad2/3的磷酸化,上调Smad7表达,显示出对TGF-β1刺激的NRK52E细胞转分化过程的阻抑作用,并与剂量呈正相关.

肾安提取液对糖尿病小鼠肾脏TGF-β1表达的影响

目的:探讨肾安提取液对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠肾脏转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响.方法:STZ诱导的糖尿病小鼠模型,随机分为模型组、厄贝沙坦组(厄贝沙坦10mg·kg-1·d-1)、肾安低、中、高剂量组(肾安提取液2.272、4.544、9.088mg·kg-1·d-1),另设正常对照组,疗程4周.检测TGF-β1 mRNA(实时荧光定量PCR法)及蛋白(Western blot分析法)、纤连蛋白(FN)及Smad7蛋白(免疫化学法)表达;透射电镜观察超微结构;并检测血糖、24h尿蛋白定量、肾质量指数、肾小球硬化指数.结果:肾安各组及厄贝沙坦组TGF-β1 mRNA及蛋白表达较模型组明显降低(P＜0.01),肾脏FN及Smad7的表达较模型组明显减少(P＜0.05,P＜0.01);肾脏超微结构改善,肾小球基底膜增厚被明显抑制(P＜0.05,P＜0.01);24h尿蛋白定量、肾质量指数、肾小球硬化指数均较模型组明显改善(P＜0.01);肾安高剂量组及厄贝沙坦组间上述指标无统计学意义;模型组及各药物干预组间血糖差异无统计学意义.结论:肾安提取液可能通过抑制TGF-β1的表达,减轻ECM积聚;并抑制TGF-β1/Smad7信号转导,减少足细胞凋亡,从而对DM肾损害起保护作用.

通脉大生片对肾虚排卵障碍型不孕大鼠卵巢TGF-β1及Smad7表达的影响

目的:观察通脉大生片对大鼠卵巢TGF-β 1、Smad7在TGF-β/smads通路中的表达变化及意义.方法:建立大鼠肾虚排卵障碍不孕(ASR)模型,通过阴道涂片筛选造模成功大鼠后分组用药,采用酶联免疫法(Elisa)法检测TGF-β 1的表达,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测大鼠卵巢中Smad7蛋白的表达量.结果:①模型组大鼠卵巢TGF-β 1的表达量低,与正常组、通高组、来曲唑组、右归丸组相比,有统计学差异(P＜0.05,P＜0.01);通脉大生片组中以通高组优;②通脉大生片高、中组来曲唑组及右归丸组Smad7表达均低于模型组(P＜0.05,P＜0.01),以通高组效果好.结论:通脉大生片可用于治疗肾虚排卵功能障碍型不孕,而其促排卵作用可能部分是通过调节TGF-β/smads信号通路中TGF-β 1及Smad7的表达,进而促进排卵障碍型不孕大鼠卵巢颗粒细胞TGF-β/smads信号通路的激活来实现的.

保元Ⅱ号对糖尿病大鼠肾脏中Smad蛋白表达的影响

目的:观察Smad在糖尿病大鼠肾脏中的表达及保元Ⅱ号对其表达的影响.方法:用链脲佐菌素腹腔注射制备糖尿病大鼠模型,随机分为空白对照组(N),模型组(DN),保元Ⅱ号治疗组(Z)和贝那普利治疗组(B),并用相应的药物干预,给药8周后处死大鼠,检测各组血浆白蛋白、血糖、尿蛋白定量、尿β2微球蛋白含量,并且用RT-PCR检测TGF-β1和Smad2,Smad3,Smad7在肾组织的表达水平.结果:与DN组相比,DN-Z组血浆白蛋白明显上升(P<0.01),血糖和尿蛋白定量、尿β2微球蛋白水平均有下降(P<0.01);TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA在模型大鼠肾组织中表达明显下调,Smad7的mRNA明显下调.干预效果与贝那普利相近.结论:保元Ⅱ号对糖尿病大鼠肾脏有保护作用,其机制可能与调节肾脏中TGF-β1和Smad2,Smad3,Smad7表达水平有关.

宣肺平喘方对慢性哮喘大鼠肺组织TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白表达的影响

目的:探讨转化生长因子(TGF-β 1)、Smad2、Smad7在慢性哮喘大鼠肺组织中的定位表达情况,以反应其在哮喘大鼠气道重建过程中的作用.方法:将SD大鼠随机分为正常组、模型组、宣肺平喘方组和地塞米松组4组,每组10只.除正常组外,其余3组均利用卵蛋白雾化吸入诱发哮喘,宣肺平喘方组和地塞米松组在雾化吸入的同时给予宣肺平喘方及地塞米松治疗.肺组织病理切片(HE染色法),荧光免疫组化法测定TGF-β 1、Smad2、Smad7蛋白在肺组织中的定位.结果:HE染色显示模型组支气管壁塌陷,周围有大量炎性细胞渗出;荧光免疫组化法显示TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白均在支气管壁和肺泡壁上表达;模型组TGF-β1、Smad2蛋白含量明显高于正常组,治疗组与模型组相比明显下降(P＜0.05);模型组Smad7蛋白含量明显低于正常组,治疗组与模型组相比明显上升(P＜0.05).结论:宣肺平喘方对哮喘气道重建有良好的治疗作用,能调节TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白的水平.

川芎嗪对肾间质纤维化模型大鼠Smad7和SnoN蛋白表达的影响

目的:探讨川芎嗪(tetramothylpyrazine,TMP)对单侧输尿管梗阻(unilatcral ureteral obstruction,UUO)所致大鼠肾间质纤维化的作用及机制.方法:雄性SD大鼠18只,随机分为3组:假手术组、模型组以及TMP组,每组6只.采用单侧输尿管结扎建立大鼠肾间质纤维化模型.川芎嗪(40mg·kg~(-1)·d~(-1))治疗3周后取梗阻侧肾组织,分别进行HE和Masson染色,观察肾组织病理改变和胶原沉积的变化;采用放射免疫分析法检测Ⅲ型前胶原含量;应用酶联免疫吸附(ELIsA)法检测肾组织中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)水平;采用Western blotting检测肾组织中Smad7和Smad转录共抑制因子SnoN蛋白表达水平的变化.结果:与假手术组比较,镜下可见模型组大鼠肾小管萎缩,管腔扩张,肾间质中大量胶原纤维沉积,肾间质明显增宽;Ⅲ型前胶原、TGF-β1含量显著增加;Smad7,SnoN蛋白表达水平显著下调.TMP组与模型组比较,肾组织病理改变明显改善,Ⅲ型前胶原、TGF-β1含量明显降低,Smad7,SnoN蛋白表达水平明显上调.结论:川芎嗪具有显著抗肾间质纤维化的作用,其机制与降低肾组织中促纤维化细胞因子TGF-β1含量,同时恢复Smad逆向调控因子Smad7和SnoN蛋白表达水平有关.

薏苡仁油对UUO大鼠肾间质纤维化的影响

目的:观察薏苡仁油对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响.方法:雄性SD大鼠54只随机分为假手术组、单侧输尿管结扎模型组和薏苡仁油治疗组(15 mL· kg-1 · d-1),术后第3,7,14天分批处死大鼠.用HE和Masson染色光镜下观察肾间质的病理改变,用免疫组织化学方法检测肾组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和转化生长因子β1(TGF-β1)表达,用Western blot法检测肾组织Smad2,Smad7蛋白的表达.结果:薏苡仁油能够改善梗阻侧肾小管间质纤维化评分,显著减少肾组织α-SMA和TGF-β1的表达,治疗组肾组织磷酸化Smad2蛋白表达显著低于模型组,而Smad7蛋白水平则明显高于模型组.结论:薏苡仁油具有抗肾间质纤维化的作用,其机制与降低肾组织中促纤维化细胞因子TGF-β1含量,抑制Smad2的磷酸化和恢复拮抗蛋白Smad7的表达有关.

积雪草苷防治支架再狭窄的生化调节机制

目的:探讨积雪草苷能否作为生化调节剂,有效减轻内皮细胞损伤,进一步抑制支架术后内中膜增生.方法:选取原代人主动脉平滑肌细胞和主动脉成纤维细胞各1株,每株细胞设空白对照组、雷帕霉素组(Rapa)、积雪草苷组(At)、积雪草苷+雷帕霉素组.利用qRT-PCR检测平滑肌细胞和成纤维细胞TGF-β1(转化生长因子1),Smad7,Ⅰ型胶原基因表达水平,通过ELISA检测Ⅰ型胶原蛋白表达量,计算积雪草苷和雷帕霉素两药相互作用指数(CDI).另将16只中华小型猪随机分为A,B2组,前降支球囊大压力预扩后,植入同型雷帕霉素支架1枚.术后A组予生理盐水30 mL·d-1静脉注射;B组予积雪草苷30 mg·kg-1·d-1(生理盐水稀释至30 mL)静注.术后7,14 d ELISA法检测2组血浆vWF(血管性血友病因子)表达水平;术后28 d复查冠脉造影,取支架血管段组织切片及染色,计算血管面积、支架内面积、管腔面积和新生内膜面积.结果:与对照组相比,两药联合组显著上调平滑肌细胞和成纤维细胞Smad7基因,下调TGF-β1,显著抑制Ⅰ型胶原基因表达(P＜0.01);平滑肌细胞中,两药联合组与Rapa组对Ⅰ型胶原抑制无显著性差异,CDI为0.83;成纤维细胞中,两药联合组优于Rapa组,存在显著性差异(P＜0.05),CDI为0.77.小型猪术后7,14 d,B组血浆vWF水平均显著低于A组(P＜0.05);术后28 d,2组血管面积和支架内面积无统计学差异;B组管腔面积显著大于A组(P＜0.05),B组新生内膜面积显著小于A组(P＜0.05).结论:积雪草苷通过上调Smad7蛋白表达,抑制TGF-β1表达,显著减少胞外基质合成与分泌,进一步抑制支架术后内中膜增生,减轻内皮细胞损伤,是雷帕霉素的有效生化调节剂.

益肾通络方对肾纤维化模型大鼠肾组织转化生长因子-β1、Smad7表达的影响

目的 探讨益肾通络方治疗肾纤维化的可能作用机制.方法 采用阳离子牛血清白蛋白皮下和尾静脉注射建立肾纤维化大鼠模型,将造模成功的50只大鼠随机分为模型组、对照组和益肾通络方低、中、高剂量组,每组各10只,并设10只同批正常大鼠为正常组.益肾通络方低、中、高剂量组分别予益肾通络方生药4.58、9.16、18.32g/ (kg·d)灌胃,对照组以肾炎四味片1.58g/ (kg·d)灌胃,模型组和正常组以等容量(1 ml/100 9)的蒸馏水灌胃,每天灌胃1次,连续4周.采用免疫组织化学方法结合图像分析系统测定大鼠肾组织转化生长因子-β1 (TGF-β1)、Smad7的平均灰度值、平均光密度值、阳性细胞数、阳性率,并进行相关性分析.结果 光镜下模型组肾组织TGF-β1表达明显增多,Smad7表达不明显.与模型组比较,益肾通络方各剂量组和对照组肾组织TGF-β1平均灰度值、阳性率、阳性细胞数明显减少,Smad7平均灰度值、阳性率、阳性细胞数明显提高,并且以益肾通络方中、高剂量作用更明显(P＜0.05或P＜0.01).相关分析显示,TGF-β1与Smad7呈线性负相关(P＜0.01). 结论 益肾通络方治疗肾纤维化可能机制是调节TGF-β1与Smad7的相互作用关系,促进Smad7表达,抑制TGF-β1表达.

蛋白酶体抑制剂MG132减轻糖尿病大鼠肾小管间质纤维化

目的 探讨蛋白酶体抑制剂MG132是否减轻或延缓糖尿病肾病(DN)大鼠肾小管间质纤维化及其可能机制.方法 用链脲菌素复制糖尿病大鼠模型(DM),实验分为对照组(NC)及DM组,每组n=10.24周处死大鼠,检测相应生化指标,观察肾组织病理改变;体外培养NRK-52E细胞,予以不同剂量MG132预处理后高糖培养.免疫组化、免疫荧光染色、Western blot检测肾组织和NRK-52E细胞中Smad7、Smurf2、E钙黏蛋白(E-cadher-in)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)及胶原蛋白(Col-Ⅰ)的表达.结果 与NC组相比,DM组大鼠肾组织E-cadherin减少(P＜0.05)、α-SMA增多(P＜0.05),FN及Col-Ⅰ蛋白在间质沉积增多(P＜0.05),而Smad7蛋白减少(P＜0.05),Smurf2表达增加(P＜0.05).MG132抑制了高糖诱导的NRK-52E细胞α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表达(P＜0.05),并呈量效依赖性,但对Smuff2的蛋白表达无影响;相反,MG132上调了Smad7蛋白及E-cadherin的表达(P＜0.05).结论 MG132减缓糖尿病大鼠肾小管间质纤维化.

MG132抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞活化

目的 探讨泛素-蛋白酶体抑制剂MG132对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肺成纤维细胞活化的影响及机制.方法 体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),随机分为对照组、TGF-β1组(10 μg/L)和MG132(0.5μmol/L)处理组.Western blot法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(αt-SMA)和Ⅰ型胶原α1(COL1 A1)的表达;RT-PCR和Westernblot法分别检测细胞Smad7、核转录共抑制因子SnoN、TGF-β Ⅰ型受体(TβRI)、Smad2和Smad3 mRNA及蛋白的表达.结果 与对照组比较,TGF-β1促进了α-SMA和COL1 A1蛋白表达(P＜0.05),MG132抑制了TGF-β1的上述作用(P＜0.05).TGF-β1组Smad7和SnoN mRNA表达较对照组增加(P＜0.05).TGF-β1组Smad7和SnoN蛋白表达较对照组减少(P＜0.05),而MG132组Smad7和SnoN蛋白水平较TGF-β1组增加(P＜0.05).结论 MG132可能通过阻止Smad7和SnoN蛋白泛素化降解,抑制TGF-β1诱导人肺成纤维细胞活化.

Smad2/3与Smad7在大鼠化疗性卵巢早衰卵泡中的表达和意义

目的 探讨顺铂对大鼠卵巢结构和功能损伤的影响及其可能的分子机制.方法 3月龄SD雌性大鼠随机分为对照组(C组,5只)和化疗组(H组,5只).H组给予每只大鼠腹腔注射顺铂2 mg/(kg.d),C组给予腹腔注射等体积生理盐水,连续注射7d后检测大鼠卵巢指数(卵巢湿重/体重);酶联免疫吸附法检测血清雌二醇(E2)和促卵泡刺激素(FSH)水平;苏木素-伊红染色观察卵泡发育并计数各级卵泡;免疫组织化学和Real-time PCR法检测各组Smad2、磷酸化Smad2(p-Smad2)、Smad3、磷酸化Smad3(p-Smad3)、Smad4和Smad7的蛋白和mRNA表达.结果 与C组相比,H组大鼠卵巢体积减小,生长卵泡数明显减少(P＜0.05),大鼠卵巢指数下降(P＜0.05),血清中E2水平降低和FSH水平上升(P＜0.05).免疫组织化学和Real-time PCR结果显示,Smad2(p-Smad2)、Smad3(p-Smad3)、Smad4和Smad7蛋白在卵巢各级卵泡均有表达,H组Smad2蛋白和mRNA表达增加(P＜0.05),Smad2磷酸化水平(p-Smad2)表达增高(P＜0.05);Smad3、Smad4和Smad7蛋白和mRNA表达减少(P＜0.05),p-Smad3表达降低(P＜0.05).结论 顺铂诱导大鼠卵泡损伤并促进卵巢早衰,引起卵泡细胞内Smad2表达增加,Smad3、Smad7表达降低,Smad细胞内信号通路参与了化疗性卵巢损伤的过程.

Smad7和组蛋白去乙酰化酶1在小鼠马兜铃酸肾病中的表达

目的 探讨Smad7、组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)在小鼠马兜铃酸肾病(AAN)中的表达及两者在马兜铃酸肾病发生、发展中的作用.方法 将32只体重(20±2)g 的SPF(无菌)雄性昆明小鼠随机分为4组,其中3组为实验组,灌胃给予不同剂量的马兜铃酸(AA)Ⅰ,分别为4 mg/(kg·d)、8 mg/(kg·d)、16mg/(kg·d).另设对照组,PBS灌胃.应用免疫组织化学、免疫印迹法及RT-PCR技术,检测AAN小鼠和正常对照组中Smad7和HDAC1的表达情况.结果 HDAC1阳性着色主要分布于细胞核上,且在AAN中的表达强度明显高于正常对照组.免疫印迹法检测和RT-PCR提示,Smad7在AAN中的表达低于对照组,而HDAC1的表达显著高于对照组.结论 在AAN中Smad7低表达以及HDAC1高表达,提示Smad7和HDAC1可能在AAN的发生、发展中起重要作用.

依那普利和厄贝沙坦对肾血管性高血压大鼠颈动脉重构及转化生长因子β1/Smads表达的影响

目的 观察依那普利和厄贝沙坦单用及联用对肾血管性高血压大鼠(RHR)颈动脉重构及转化生长因子β1(TGF-β1)/Smads表达的影响.方法　8～12周龄雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠30只.建立“两肾一夹”RHR模型,设立模型组、假手术组、依那普利组[10 mg/(kg·d)]、厄贝沙坦组[50 mg/(kg· d)]、联合用药组[厄贝沙坦25 mg/(kg·d)十依那普利5mg/(kg,d)],每组6只大鼠.药物连续干预6周.采用HE染色、Masson染色法及免疫组化染色检测颈动脉中膜形态及结构变化并测量中膜厚度、中膜厚度/腔径以及颈动脉中膜a肌动蛋白(α-actin)、增殖细胞核抗原(PCNA)、TGF-β1、磷酸化Smad2/3 (p-Smad2/3)、Smad7的表达水平.结果 RHR模型组颈动脉中膜明显肥厚,平滑肌细胞体积增大,排列紊乱；中膜厚度、中膜厚度/腔径、颈动脉中膜平滑肌细胞的增殖指数及胶原纤维面积百分比均高于假手术组[中膜厚度(91.28±11.17)比(52.15±7.18) μm,中膜厚度/腔径(20.75±3.07)％比(9.94±1.52)％,增殖指数(35.31±12.97)％比(1.84±0.52)％,胶原纤维面积百分比(67.53±7.68)％比(15.35±4.47)％,均P＜0.01]；TGF-p-和p-Smad2/3的表达较假手术组均增多(均P＜0.05),Smad7表达较假手术组减少(P＜0.01).依那普利和厄贝沙坦均能改善颈动脉平滑肌肥大和胶原沉积,减小RHR颈动脉中膜厚度、中膜厚度/腔径、平滑肌细胞的增殖指数、胶原纤维面积百分比及TGF-β1和p-Smad2/3的表达(P＜0.05),增加Smad7表达(P＜0.01),且两药联用较单用更能改善颈动脉重构,降低TGF-β1和p-Smad2/3的表达(P＜0.05),增加Smad7表达(P＜0.05).结论 依那普利和厄贝沙坦通过影响TGF-β1/Smads信号通路中TGF-β1、p-Smad2/3和Smad7的表达而改善RHR颈动脉重构,且两药联用有协同作用.

纤维化胰腺组织中TGF-β1、Smad3、Smad7的表达及意义

目的:检测人纤维化胰腺组织中TGF-β1,Smad3和Smad7蛋白的表达,探讨他们在胰腺组织纤维化发生中的意义.方法:采用免疫组织化学SP法检测34例纤维化胰腺组织标本中TGF-β1,Smad3和Smad7蛋白的表达,并以同期15例正常胰腺组织作对照.结果:TGF-β1,Smad3在纤维化胰腺组织中的表达(79.4%,64.7%)明显高于正常胰腺组织(6.7%,20.0%)(P＜0.01),Smad7在纤维化胰腺组织中的表达(26.5%)则低于正常胰腺组织(73.3%)(P＜0.01),纤维化胰腺组织中TGF-β1的表达与Smad3的表达呈正相关(r=0.385,(P＜0.05)而与Smad7的表达呈负相关(r=-0.519,P＜0.01).结论:TGF-β1,Smad3和Smad7在胰腺纤维化形成过程中起不同的介导作用,通过靶向性阻断TGF-β1、Smad3信号和(或)加强Smad7信号可能成为治疗胰腺纤维化的新手段.

Smad7质粒转染对肝星形细胞α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原基因表达的影响

目的:研究上调Smad7表达对肝星形细胞(HSC)α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原基因转录的作用.方法:应用Fugene6介导Smad7质粒转染体外培养的HSC-T6细胞.继续培养48 h.同时使用实时定量聚合酶链式反应(Real time-PCR),逆转录酶链式反应(RT-PCR)方法检测Smad7质粒组和正常对照组、空载质粒对照组α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原mRNA水平.结果:与正常对照组和空载质粒对照组相比,Smad7质粒转染HSC-T6细胞48 h后,Smad7mRNA水平显著增高(1.29±0.18 vs 0.11±0.02,0.13±0.02,均P＜0.01),α1(Ⅰ)前胶原mRNA表达明显下降(0.10±0.01 vs 1.18±0.15,1.07±0.12,均P＜0.01),但α1(Ⅲ)前胶原基因表达无明显改变(0.72±0.00 vs 0.70±0.01,0.75±0.01,均P＞0.05).结论:Smad7能明显抑制HSC细胞α1(Ⅰ)前胶原mRNA转录.

uPA基因修饰骨髓源性肝干细胞移植对肝纤维化大鼠TGF-β-Smads信号通路的影响

目的:探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSC)移植对CC14诱导的大鼠肝组织转化生长因子-β-Smads(TGF-β-Smads)信号通路的影响.方法:采用皮下注射CC14建立大鼠肝纤维化模型.将纯系Fisher大鼠随机分为正常组、模型组、BDLSC组(尾静脉注入2×10(6)BDLSC)和BDLSC-uPA组(尾静脉注入2×10(6)AduPA转染的BDLSC),每组9只.观察各组大鼠肝功能和病理组织学变化;采用免疫组织化学法或Western blot法分别检测大鼠肝组织TGF-β1,Smad3及Smad7蛋白表达变化.结果:与模型组和BDLSC组相比,BDLSC-uPA组大鼠肝脏结缔组织增生程度减轻,假小叶形成不明显,肝功能明显改善;肝组织TGF-β1蛋白表达明显低于模型组和BDLSC组(0.1849±0.0456vs0.8202±0.0636,0.2936±0.0548,均P<0.05),而Smad3和Smad7蛋白表达无明显变化.结论:uPA基因修饰BDLSC移植可能部分通过抑制TGF-β1蛋白表达,从而发挥抗肝纤维化的作用.

大鼠Smad7真核表达质粒的构建及在肝星状细胞中的表达

目的:构建并鉴定大鼠Smad7真核表达质粒,观察外源Smad7对肝星状细胞HSC-T6的转染.并进一步研究其对TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA达水平的影响.方法:采用基因重组技术将Smad7 cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建大鼠Smad7真核表达质粒.脂质体介导转染HSC-T6细胞,分为正常对照组、空质粒组及转染组,G418筛选,挑取阳性细胞,运用Western blot检测Smad7蛋白表达情况,RT-PCR检测Smad7、TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达水平.结果:酶切和测序结果证实Smad7真核表达质粒构建成功.Smad7转染组与正常对照、空质粒组比较,Smad7 mRNA表达显著增加(1.053±0.009 VS 0.984±0.054,0.986±0.044,P<0.01或0.05),蛋白水平显著上调(0.083±0.02 VS0.058±0.050,0.056±0.064,均p<0.05:Smad7转染组TGF-β1、Ⅰ型胶原mRNA表达降低(0.961±0.013 VS 1.039±0.013,1.032±0.037;0.592±0.096 VS 0.767±0.085.0.770±0.090,均P<0.01);Ⅲ型胶原mRNA表达差异无统计学意义.正常对照、空质粒组Smad7 mRNA和蛋白水平、TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNAA达差异无统计学意义.结论:smad7可能参与TGF-β/smad信号转导,在一定程度上具有抗纤维化的生物学活性.