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肝脏胶原蛋白检测进展与评析
胶原含量多少可以直接反映肝脏纤维化程度之轻重,胶原蛋白含量测定在肝纤维化机制与药理研究中极其重要,往往是结果分析的"终点指标".综述肝脏胶原蛋白的生化与病理检测方法,结合个人实践体会,分析其各种不同方法的特点及适应范围.认为肝组织胶原蛋白以羟脯氨酸含量检测可靠,培养细胞总胶原分泌宜采用同位素掺入与胶原酶消化的方法,各型胶原分泌量可采用ELISA法,各型胶原沉积量可采用Western blot法.肝组织与培养细胞胶原病理染色,主要用于胶原蛋白定性分析与表达位置检测,正确应用图像分析可半定量.
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明胶降解物对大鼠真皮成纤维细胞增殖及Ⅰ型胶原蛋白分泌的影响
目的 探讨组织工程心瓣膜常用人工基质材料--明胶发生降解后的产物对大鼠真皮成纤维细胞增殖及Ⅰ型胶原蛋白分泌的影响. 方法 利用酶组合技术制备明胶降解物(gelatin hydrolysate, GH),采用超滤的方法分离出低分子量明胶降解物组分(gelatin hydrolysate fraction, GHF),用于5只SD大鼠真皮成纤维细胞的体外培养.采用CCK-8活细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8)检测细胞的增殖情况,ELISA试剂盒检测细胞I型胶原蛋白的分泌情况. 结果 ①GHF对细胞增殖作用的浓度效应:在0.125～1.0 mg/ml浓度范围内,GHF对细胞的促增殖作用呈现先增强后减弱的趋势,在0.25 mg/ml时,细胞增殖率大,达到(47.54±16.35)%;②GH与GHF对细胞增殖影响比较:GH与GHF均具有促进细胞增殖的作用,且在浓度为0.25 mg/ml时,促细胞增殖作用无显著差异[(27.04±15.21)% vs (39.22±15.55)%, P=0.177];③GH与GHF对细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白影响比较:GHF组第3天时Ⅰ型胶原分泌量为(28.06±5.60)pg/105,与空白对照的(18.24±4.52)pg/105相比,有显著差异(P=0.006),而GH组直至第6天时Ⅰ型胶原蛋白分泌量,与空白对照相比,无统计学意义(P=0.103). 结论 分子量大小不同的明胶降解物GH与GHF均具有促进大鼠真皮成纤维细胞增殖的作用,且分子量较小的GHF还具有促进细胞I型胶原分泌的功能.
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THEM4与高糖诱导的人胚肾上皮细胞胶原分泌的关系
目的 探讨硫酯酶超家族成员4(thioesterase superfamily member 4,THEM4)在高糖刺激的人胚肾上皮细胞(human embryo kidney epithelial cells,HKC)内的表达以及与胶原分泌的关系.方法 体外培养HKC,分别给予高糖(30 mmol/L)刺激0、6、12、24和48 h后,收集细胞.提取RNA,Real-time PCR检测THEM4 mRNA的表达;提取总蛋白,Western blot检测THEM4、phospho-Akt(Ser 473)、转化生长因子β1 (transforming growth factor ββ,TGF-β1)、平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达;免疫细胞荧光检测THEM4蛋白表达和定位;ELISA方法检测细胞上清液中Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原(collagenⅢ,ColⅢ)分泌情况.结果 ①高糖培养HKC内THEM4表达明显降低,伴随phospho-Akt (Ser 473)、TGF-β1和α-SMA表达上调;THEM4与TGF-β1和αSMA表达呈负相关(分别为:y=-5.100 9x+ 1.178,R2=0.971 1;y=-3.803 3x+1.408,R2=0.893 9).②高糖可刺激HKC分泌Col Ⅰ、ColⅢ.结论 高糖诱导的HKC胶原的分泌可能是通过抑制THEM4表达,上调phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1和α-SMA蛋白表达而实现的.
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Syndecan-1对大鼠心肌成纤维细胞生物学行为影响
目的 评估syndecan-1(Sdc1)对大鼠心肌成纤维细胞生物学行为的影响,为心肌梗死(MI)后心室重构的防治提供依据.方法 体外分离培养SD大鼠乳鼠心肌成纤维细胞,分别转染Sdc1 siRNA质粒和Sdc1高表达质粒,并设立空白对照组、无关序列和空载质粒作为阴性对照.采用流式细胞术检测细胞增殖,CCK-8法检测细胞活力,酶联免疫法(ELISA)检测胶原(羟脯氨酸)分泌能力及Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力.结果 Sdc1 siRNA组心肌成纤维细胞S期比例、增殖指数、细胞活力、胶原(羟脯氨酸)分泌量和迁移细胞数分别为(8.36±0.23)％、(13.2±0.5)％、(1.72±0.12)、(1162.3±60.4) pg/mL和170个/孔,明显高于空白对照和阴性对照组(P ＜0.01);Sdc1高表达质粒组心肌成纤维细胞S期比例、增殖指数、细胞活力、胶原(羟脯氨酸)分泌量和迁移细胞数分别为(6.48±0.22)％、(10.8±0.6)％、(1.30±0.11)、(346.8±52.1)pg/mL和50个/孔,明显低于空白对照和空载质粒组(P＜0.01).结论 Sdc1能够抑制心肌成纤维细胞的增殖、活力、迁移和分泌能力.
关键词： Syndecan-1 细胞增殖 细胞迁移 胶原分泌 生物学行为 -
角质形成细胞源TGF-β1对成纤维细胞的作用
目的 研究正常角质形成细胞分泌的TGF-β1对正常成纤维细胞生物学行为的影响.方法 采用免疫组化方法检测角质形成细胞分泌TGF-β1,以不同浓度TGF-β1抗体阻断角质形成细胞条件培养液中的TGF-β1,观察阻断前后角质形成细胞条件培养液对正常成纤维细胞增殖,胶原分泌的影响.结果 细胞玻片可见大量染色阳性角质形成细胞,经TGF-β1抗体阻断后的角质形成细胞条件培养液,对成纤维细胞的促增殖作用明显减弱,胶原分泌减少.结论 正常角质形成细胞分泌大量TGF-β1,可促进成纤维细胞增殖,促进胶原分泌.
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褪黑素对自身免疫性肝炎大鼠肝星状细胞透明质酸、Ⅲ型前胶原分泌及Ⅰ型胶原mRNA表达的抑制作用
本研究在自身免疫性肝炎(AIH)大鼠模型肝星状细胞培养过程中加入褪黑素(MT),检测培养上清中透明质酸(HA)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)的含量,并采用RT-PCR法观察MT对肝星状细胞(HSC)表达Ⅰ型胶原(colⅠ)mRNA的影响.
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血管紧张素Ⅱ调控大鼠肝星状细胞血管紧张素Ⅱ受体表达及其功能的影响
国内外学者在心、肾、肺等脏器纤维化实验研究中发现,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)能刺激这些脏器组织间质成纤维细胞胶原分泌,证实AngⅡ参与组织纤维化的形成.现已证实AngⅡ调节血压、水电解质平衡和细胞生长都是通过AngⅡⅠ型受体(AT1R)发挥作用.在肝纤维化发生过程中,肝星状细胞(HSC)是否也表达AT1R和AT2R,为此我们观察了AngⅡ对大鼠HSC表达AngⅡ受体(ATR)及前胶原基因的调控情况,旨在探讨AngⅡ对HSC功能的影响及其机制.
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肝星状细胞和肝细胞合成及分泌胶原的比较研究
目的为了明确肝细胞(hepatocyte, HC)和星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)在肝纤维化胶原合成和分泌中的作用.方法本文在分离培养大鼠HC和SHC的基础上,用H-L-脯氨酸掺入法和胶原酶消化法分析体外培养的HC和HSC胶原合成和分泌功能.结果发现HC和HSC合成胶原的能力相似(P>0.05),而HSC分泌胶原能力较强(P<0.05～0.01).结论 HSC在肝脏胶原合成和分泌中可能起主要作用,但HC的作用也不容忽视.
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当归、川芎、丹参、黄芪提取液对肺成纤维细胞的影响
目的:研究中药当归、川芎、丹参、黄芪对体外培养的肺成纤维细胞的影响.方法:采用酶消化法培养肺成纤维细胞,应用MTT比色法、羟脯氨酸比色法检测中药对肺成纤维细胞的增殖、生长曲线及分泌胶原的影响.结果:与空白对照组比较.川芎与当归在中、低剂量组,黄芪的各剂量组肺成纤维细胞受到明显的抑制,同时胶原分泌量也明显降低.结论:当归、黄芪、川芎有明显抑制肺成纤维细胞的增殖及胶原分泌的作用.
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雷公藤内酯醇对成纤维细胞的影响
目的:研究雷公藤内酯醇(Tri)对成纤维细胞的细胞动力学及形态学影响,以探讨其抑制增生性瘢痕的机制. 方法:用光镜、电镜观察用药前后成纤维细胞的形态学变化,用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡. 结果:用药组在光镜下细胞密度较低,细胞体细长,部分失去正常的细胞形态、细胞质红染,并可见典型的凋亡小体;电镜下粗面内质网疏松,内容物减少,并可见各期凋亡细胞.细胞动力学检测(FCM)示用药组凋亡比例(AI)明显增加,并呈一定的量效关系,对细胞周期则无影响. 结论:Tri促进成纤维细胞的凋亡,可能对胶原的分泌也有一定的影晌.
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生肌玉红膏通过下调TGF-β1/Smads抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原分泌
目的 探讨生肌玉红膏(SJYHG)对人增生性瘢痕成纤维细胞(hHSF)增殖、胶原分泌及TGF-β1/Smads通路的影响.方法 采用原代培养的hHSF模型,加入SJYHG培养后,CCK-8法测定450nm波长各孔溶液吸光度值(A值),荧光定量PCR检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA表达,WB检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原和P-Smad2、P-Smad3的蛋白表达.结果 SJYHG浓度依赖地极显著地抑制hHSF增殖(P＜0.001),并显著抑制了α-SMA和Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA和蛋白表达(P＜0.05),显著下调P-Smad2和P-Smad3的蛋白表达(P ＜0.001).结论 SJYHG具有潜在的抑制增生性瘢痕的作用.
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megsin基因对高糖环境中肾小球系膜细胞炎性介质的影响
megsin表达增多可能与以系膜细胞增生和细胞外基质沉积为主的肾小球疾病关系密切[1].炎性反应在糖尿病肾病(DN)的发生发展中起关键作用已被广泛接受.单核细胞趋化蛋白1( MCP-1)过度表达介导大量巨噬细胞趋化和激活,加重糖尿病肾损伤.经检索,尚未见关于megsin与MCP-1的关系,及其在DN发病机制中的作用的报道.本实验通过体外转染megsin基因,观察高糖环境下megsin基因对系膜细胞MCP-1表达及Ⅳ型胶原分泌的影响,探讨megsin在DN发生、发展中的作用机制.
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角质形成细胞条件培养液对成纤维细胞增殖与胶原分泌影响的研究
目的探讨正常的角质形成细胞对成纤维细胞生物学行为的影响. 方法组织块法培养成纤维细胞,分别加入12.5%、25%与50%浓度的角质形成细胞条件培养液为实验组,加入不含血清DMEM为对照组,采用MTT、羟脯氨酸比色法测定成纤维细胞增殖、胶原合成;以流式细胞仪测定50%浓度角质形成细胞条件培养液组及对照组成纤维细胞生长周期. 结果细胞增殖测定,各实验组吸光度(A)值与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);随浓度增高,A值增加,25%及50%浓度组与12.5%浓度组比较,差异有统计学意义(P<0.01);25%及50%浓度组间比较,差异无统计学意义(P>0.01).胶原合成测定中,各实验组A值与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.01);各实验组组间比较,差异无统计学意义(P>0.01).细胞周期测定见,50%浓度组可明显促进成纤维细胞通过G1/S及S/G2限制点,S期及G2/M期细胞与对照组相比明显增多,G0/G1期细胞与对照组相比明显减少,差异均有统计学意义(P<0.01). 结论正常角质形成细胞的上清液可促进成纤维细胞的增殖,但对其胶原分泌影响不明显.
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角质形成细胞源IL-1α对成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响
目的:研究角质形成细胞分泌的IL-1α对成纤维细胞生物学行为的影响.方法:组织块法培养成纤维细胞,消化法培养角质形成细胞,采用免疫组化方法检测角质形成细胞分泌的IL-1α;成纤维细胞中加入含不同浓度IL-1α抗体(0.04 μg/ml,0.2 μg/ml,1 μg/ml)的角质形成细胞条件培养液为实验组,含DMEM的条件培养液为对照组,采用Cell counting kit-8、放免法测定成纤维细胞增殖、胶原合成.结果:细胞爬片可见大量染色阳性角质形成细胞,细胞增殖测定,各实验组吸光度(A)值与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01);随抗体浓度增高,A值减小,0.2 μg/ml及1 μg/ml浓度组与0.04 μg/ml浓度组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);胶原分泌浓度测定,各实验组与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01);随抗体浓度及胶原浓度增高,0.2 μg/ml及1 μg/ml浓度组与0.04 μg/ml浓度组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:正常角质形成细胞分泌大量IL-1α,可促进成纤维细胞增殖,抑制胶原分泌.
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冷冻干燥牙本质对牙周膜干细胞影响的研究
目的:制作冷冻干燥牙本质生物支架(FDDM)并研究其对牙周膜干细胞(PDLSCs)的影响.方法:制作FDDM生物支架;将PDLSCs分别接种在FDDM、普通牙本质(D)、羟基磷灰石/磷酸三钙(HA)、盖玻片/α-MEM表面或浸提液中.MTT法检测细胞增殖;粘胶纤维红检测胶原分泌量;扫描电镜检测细胞形态;共聚焦显微镜观察各组细胞骨架形态.结果:研制出FDDM;MTr结果显示FDDM组细胞增殖活性高于HA组(P＜0.05);胶原检测显示FDDM组细胞分泌的胶原多于HA组(P＜0.05);电镜结果显示FDDM组细胞紧密粘附,细胞突起的数目和长度大于HA与盖玻片组;共聚焦结果显示,FDDM组细胞骨架较HA、盖玻片组粗大、清晰.结论:FDDM促进PDLSCs的增殖、胶原分泌,促进细胞粘附及细胞应力纤维形成.
关键词： 冷冻干燥牙本质(FDDM) 牙周膜干细胞 胶原分泌 细胞骨架
