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中国汉族人群中α-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)基因多态性与阿尔茨海默病的关联性研究
目的研究中国汉族人群中α-抗胰凝乳蛋白酶启动子区-51(ACT-51)G/T多态性与阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)发病的相关性. 方法通过实时定量荧光PCR和GeneAmp 5700 SDS软件检测544例AD患者和557例非痴呆对照者ACT-51G/T的基因多态性,应用logistic 回归模型分析与AD发病的相关性.结果 ACT的G/G、G/T和T/T在AD组和对照组中分布差异存在显著性,携带T/T基因型比携带G/G基因型个体显示出较高的AD发病危险性(OR=1.50,P<0.05);非条件Logistic回归模型分析提示ACT的T/T和G/T基因型、高龄和女性均为AD发病的危险因素,调整年龄和性别影响后T/T和G/T基因型均为AD发病的危险因素,且对AD发病存在剂量效应关系,其OR值分别为3.55和1.55,P值分别为0.000和0.015.结论在中国汉族人群中ACT-51 T/T和C/T基因型、高龄和女性为AD发病的危险因素,共同影响AD的发病.
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Mylpf基因在自发性糖尿病长爪沙鼠6种组织中的表达水平分析
目的 分析Mylpf基因在糖尿病长爪沙鼠6种组织中的表达水平,进而探究长爪沙鼠糖尿病发生的分子机制.方法 选取糖尿病长爪沙鼠和正常沙鼠各6只,使用Real-time PCR和Western blotting技术分别检测动物的骨骼肌、肝脏、脂肪、肾脏、心脏和脑组织中Mylpf的mRNA和蛋白表达水平.结果 Real-time PCR的结果表明,在骨骼肌、心脏和脑组织中,Mylpf在糖尿病组mRNA表达水平高于对照组.在脂肪组织和肝脏组织中糖尿病组mRNA表达水平低于对照组.在肾脏组织中两组mRNA表达水平基本相同.Western blotting结果显示,在骨骼肌中Mylpf在糖尿病组蛋白表达水平高于对照组,且有统计学差异,在心脏和脂肪组织中Mylpf在糖尿病组蛋白表达水平低于对照组,在肾脏组织中蛋白表达水平基本相同,在肝脏和脑组织中没有检测出.结论 Mylpf与长爪沙鼠糖尿病的发生有一定相关性,该基因对长爪沙鼠糖尿病的影响可能主要发生在骨骼肌和心脏组织中.
关键词： 长爪沙鼠 2型糖尿病 Mylpf 实时定量荧光PCR Western blot -
Nf-κb在遗传性糖尿病长爪沙鼠多种组织中的表达状况
目的 探讨糖尿病长爪沙鼠6种组织中Nf-κb基因mRNA和蛋白的表达水平,以期探索长爪沙鼠糖尿病模型中Nf-κb的作用和靶器官.方法 选取糖尿病长爪沙鼠和正常血糖沙鼠各6只,分别采集动物的骨骼肌、肝脏、脂肪、肾脏、心脏和脑组织,用Q-PCR和Western blotting检测Nf-κb在各组织中mRNA和蛋白表达水平.结果 与对照动物相比,在糖尿病长爪沙鼠的肌肉、肾脏和脑组织中,Nf-κb基因的mRNA水平表达有升高趋势,脂肪中则显著降低,肝脏和心脏中仅有降低趋势.检测蛋白水平发现除肝脏外,其他组织的结果均与mRNA水平一致.结论 糖尿病长爪沙鼠脂肪组织是Nf-κb作用的靶器官.
关键词： 长爪沙鼠 Ⅱ型糖尿病 NF-κB 实时定量荧光PCR Western blot -
单纯疱疹病毒2型ICP4基因荧光实时定量PCR检测方法的建立
目的 建立实时荧光PCR定量检测单纯疱疹病毒2型(HSV2)ICP4基因的方法.方法 依据HSV2 ICP4基因序列设计引物.PCR纯化后克隆到pMD-18T载体上进行测序,抽提重组质粒作为标准品.根据测序结果设计荧光定PCR的引物和探针,质粒标准品10倍稀释后进行扩增,建立标准曲线,并进行灵敏度和可靠性分析.结果 测序结果显示在扩增的PCR片段中有在A-G无和T-C的无义突变.标准品101以下没有检测信号,101具有明确的检测信号,因而检测的灵敏度为10.可靠性测定结果:107-101进行10次重复Ct值的平均值分别为14.275±0.137、17.988±0.162、22.081±0.259、25.957±0.345、29.565±0.203、33.269±0.287、37.737±0.698,变异系数分别为0.965%、0.902%、1.174%、1.329%、0.686%、0.862%、1.851%.Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系.回归系数为0.998.结论 成功建立了HSV2 ICP4基因实时定量荧光PCR检测的方法,灵敏度高,重复性好,可用于HSV2 ICP4基因的定量分析.
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自发性糖尿病长爪沙鼠Rxra在6种组织中的表达水平分析
目的 分析糖尿病长爪沙鼠Rxra基因在6种组织中的表达水平,以期探索长爪沙鼠糖尿病发生的分子机制.方法 选取糖尿病长爪沙鼠和正常沙鼠各6只,分别采集动物的骨骼肌、肝脏、脂肪、肾脏、心脏和脑组织,用Real?time PCR和Western blotting检测Rxra基因在各组织中mRNA和蛋白表达水平.结果 Real?time PCR的结果表明,Rxra基因的mRNA水平在糖尿病组动物骨骼肌和脂肪中显著降低,在肝脏中无差异,而在肾脏、心脏和脑组织中则有高表达趋势.Western blotting结果显示,糖尿病组RXRA的蛋白水平在骨骼肌组织中显著降低,在脂肪组织几乎检测不到,在其他各组织表达情况有所不同,但没有统计学差异.结论 Rxra在糖尿病长爪沙鼠骨骼肌和脂肪组织中低表达,在其他4种组织中表达水平无差异,说明Rxra对长爪沙鼠糖尿病的影响主要发生在骨骼肌和脂肪组织中.
关键词： 长爪沙鼠 2型糖尿病 RXRA 实时定量荧光PCR Westernblot -
荧光实时定量 PCR 检测 STAT 6圈套寡核苷酸对支气管哮喘小鼠脾淋巴细胞转录IL-4 mRNA 的影响
目的：研究STAT6圈套寡核苷酸（ODN）对支气管哮喘（简称哮喘）小鼠脾淋巴细胞转录IL‐4 mRNA的影响作用。方法实验细胞分组：空白组（A组）、哮喘OVA组（B组）、治疗哮喘OVA组（C组）、干扰哮喘OVA组（D组）、脂质体哮喘OVA组（E组）。设计并人工合成STAT6圈套ODN及无序ODN ，全硫代修饰的ODN。用OVA和氢氧化铝复制哮喘模型，用淋巴细胞分离液分离小鼠脾淋巴细胞，体外培养后，导入由阳离子脂质体2000转染剂携带的圈套ODN进入淋巴细胞培养，抽提RNA进行反转录，建立实时荧光聚合酶链反应（PCR）反应条件，通过比较ct进行基因表达的相对定量分析。观察圈套ODN的转染对脾淋巴细胞转录IL‐4 mRNA的影响。结果 A、B、C、D、E组的IL‐4 mRNA分别表达为：0．02545±0．00433，0．06742±0．00128，0．03151±0．00530，0．06504±0．00775，0．05952±0．00561。A组和C组低于B组、D组和E组，其差异有统计学意义（ t＝6．204，P＜0．01），C组和A组间差异无统计学意义（t ＝1．310，P ＞0．05），B组和D组、E组之间的差异无统计学意义（P ＞0．05）。结论熔解曲线分析结果证明了PCR反应的特异性，应用SYBRG reen I实时荧光PCR可以特异、准确地分析STAT6圈套ODN能下调STAT6活性，降低转录IL‐4 mRNA的表达。
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97例先天性心脏病儿童DNMT表达情况分析
目的:DNA甲基化转移酶(DNA methylation transferase,DNMT)表达异常可能在先天性心脏病(Congenital heart disease,CHD)心脏缺损中发挥重要作用.本文旨在探讨CHD儿童DNMT表达情况与非CHD儿童DNMT表达情况是否存在差异.方法:收集97例包含房间隔缺损(ASD)、室间隔缺损(VSD)或动脉导管未闭(PDA)的CHD儿童与50例非CHD儿童外周血,提取白细胞总RNA.采用及real-time RT-PCR检测两组儿童DNA甲基化转移酶1(DNMT1)及DNA甲基化转移酶3B(DNMT3B)mRNA表达水平.结果:CHD病例组儿童外周血中DNMT1和DNMT3B mRNA表达水平均较正常对照组高(P<0.01).结论:DNA甲基化转移酶异常升高可能在CHD发病机制中发挥重要作用.
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实时荧光PCR法定量小腿慢性静脉性溃疡表面的细菌分布
背景:小腿慢性静脉性溃疡表面的细菌在溃疡的愈合过程中起重要作用,但细菌的种类、密度与溃疡愈合的关系仍然存在争议.目的:探讨小腿慢性静脉性溃疡中的常见菌群种属和细菌量与溃疡愈合的关系.方法:纳入2009-05/2010-09重庆医科大学第一附属医院血管外科诊断为小腿慢性静脉性溃疡患者39例,共42条患肢.所有患者均进行标准的加压疗法治疗,经过6个月的随访以确定溃疡的愈合率,42条患肢中,28条患肢在6个月内完全愈合,为愈合组,14条患肢未完全愈合,为未愈合组.获取治疗前所有溃疡的组织样本,提取样本中的细菌基因组DNA,合成细菌的通用引物及下肢慢性静脉性溃疡中常见细菌种属的特异性引物,运用常规PCR及荧光定量PCR方法比较愈合组与未愈合组溃疡表面的细菌差异.结果与结论:愈合组和未愈合组标本中都可检测到细菌,常见的细菌为金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌.荧光定量PCR结果显示未愈合组标本中的细菌总量较愈合组明显增多(P < 0.05),两组中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌的含量无明显差异(P > 0.05).实验结果中未见任何一种溃疡的常见细菌种属与溃疡的愈合具有直接关系,而溃疡中的细菌总量与溃疡的愈合有较大的关联.结果表明溃疡表面细菌总量的增加引起的皮肤慢性感染可能是导致小腿慢性静脉性溃疡长期不愈合的重要原因.
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兔股骨头坏死模型的血管内皮生长因子和Bcl-2的表达
目的:研究兔激素相关性股骨头坏死股骨头内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和抑制凋亡基因(Bcl-2)表达的动态变化特点.方法:健康雄性新西兰兔30只,随机分为实验组20只和对照组10只,实验组经耳缘静脉注射10 μg/kg的脂多糖二次,再肌肉注射地塞米松25 mg/kg三次,对照组注射同等剂量的生理盐水,在造模至第4、8、12周后,处死动物,通过免疫组化、实时定量荧光PCR法检测不同时间点VEGFmRNA和Bcl-2mRNA表达.结果:在造模至第4、8、12周时,股骨头内VEGF和Bcl-2基因的表达免疫组化结果均为阴性；股骨头内VEGF和Bcl-2基因的表达随着时间推移各组表达量逐渐降低,与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).结论:在地塞米松联合脂多糖建立的股骨头坏死模型中,股骨头内的VEGF和Bcl-2基因表达均受抑制.
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PTK787对早产儿视网膜病变大鼠模型血管内皮生长因子及其受体mRNA表达的影响
目的:研究受体酪氨酸激酶亚群抑制剂PTK787对早产儿视网膜病变(ROP)大鼠模型血管内皮生长因子(VEGF)及其受体VEGFR-2 mRNA的影响.方法:建立波动氧(80％和10％氧浓度24h交替)诱导的SD大鼠ROP模型.67只新生SD大鼠随机设立空气组、模型组、治疗组(腹腔注射PTK787 50 mg/kg)；每组随机抽取6只新生鼠,利用实时定量荧光PCR,观察生后12天及第17天的视网膜组织VEGF与VEGFR-2 mRNA表达,数据采用比较CT值法(2-CT法)分析基因相对表达量.选择GAPDH为内参.结果:12天及17天模型组较对照组VEGF与VEGFR-2 mRNA表达量明显增多,而治疗组未见异常.结论:PTK787对ROP病变大鼠模型VEGF与VEGFR-2 mRNA表达呈明显的负性调控作用.
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荧光实时定量PCR检测非小细胞肺癌组织及外周血中RRM1 mRNA表达水平的方法
目的:建立检测非小细胞肺癌患者肿瘤组织及外周血RRM1 mRNA表达水平的实时定量荧光PCR方法,比较不同标本的检测方法及效果,为临床应用该基因表达水平预测药物疗效提供方法基础.方法:构建RRM1基因的质粒标准品,运用ABI7000 PCR仪进行实时定量分析,探索佳反应条件并建立标准曲线用以检测临床标本.结果:检测了18例患者的肺癌及正常肺组织标本,同时检测了17例患者的外周血标本,以β-actin为管家基因计算得肺癌组织相对表达量平均为4.46×10-3,正常肺组织为3.43×10-3,外周血为2.54×10-3.Ct值与模板起始浓度对数值之间有良好的线性相关.结论:所建SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法能成功检测肺癌组织及外周血单个核细胞RRM1 mRNA表达水平,检测方法基本相同,有较高的敏感性与特异性,可应用于临床检验工作.
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低丰度基因Real-time PCR相对定量方法的建立
低丰度基因通常难以通过标准曲线法进行Real-time PCR.通过使用特异引物,对拟南芥低丰度表达基因CIPK7进行了转录水平上的定量分析,成功建立了可检测低丰度基因表达变化的Real-time PCR标准曲线定量方法.扩增CIPK7基因CDS全长,并对PCR产物进行纯化,使用纯化的PCR产物作为标准品,绘制标准曲线,对CIPK7基因的表达进行Real-time PCR分析.与常规Real-time PCR方法进行比较,结果表明,该方法得到的标准曲线,浓度区间范围广,线性关系好,能够很好地适用于低丰度基因的Real-time PCR标准曲线法定量.实验测得低温胁迫下拟南芥CIPK7基因的表达量,随低温处理时间增长,有明显的先升高后降低的变化.
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荧光实时定量PCR方法在肺癌相关基因检测中的应用
目的 研究实时定量荧光PCR在非小细胞肺癌患者肿瘤组织、正常组织及外周血中RRM1、ERCC1表达水平检测的应用价值.方法 构建目的 基因质粒标准品,运用PCR仪进行SYBR荧光实时定量分析,比较其表达水平.结果 两者在外周血中表达水平与TNM分期、是否淋巴转移等有关;肿瘤组织和外周血中的表达具有一致性.结论 荧光实时定量PCR具有良好的特异性和灵敏度,费用低,操作简便,可应用于临床检验工作.
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SSH技术筛选家蝇抗感染差异基因
目的 为了解家蝇抗菌分子免疫机制及效应免疫分子的表达情况,运用ssh、real-time PCR,构建家蝇差异表达消减文库.方法 以金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)和球孢白僵菌(Beauvoir bassinet bacteria),感染家蝇幼虫构建金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和球孢白僵菌感染的差减文库,成功构建了家蝇抗感染差异表达cDNA文库.结果 文库的阳性克隆进行PCR鉴定主要分布在250～750 bp之间,随机挑取252个白斑进行测序和同源性分析,应用反向Northern斑点杂交技术鉴定了35个基因,其中32个为真阳性,包括抗菌肽、酶、核糖体蛋白,以及一些功能不明的蛋白.结论 运用real-time PCR技术分析了三种蛋白基因的表达情况,结果显示诱导后不同时间点,不同发育阶段抗菌肽均普遍表达,但表达水平存在着明显的差异,诱导后表达明显升高.
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白细胞介素-10基因多态性与西藏地区慢性乙型肝炎的相关性研究
目的 观察中国藏族人群中白细胞介素-10(IL-10)基因多态性与慢性乙型肝炎(CHB)患者发病的相关性.方法 选取藏族CHB患者113例及同期体检健康的藏族人群77例,通过实时定量荧光PCR及GeneAmp SDS软件检测IL-10-819位点的基因多态性.结果 CHB组患者IL-10-819位点基因T/C多态性中,TT基因发生频次低于对照组(P＜0.05),等位基因的发生频次差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在中国藏族人群中,IL-10-819TT基因型的存在降低了HBV感染的风险,为藏族人HBV发病的保护性因素,IL-10-819基因多态性与藏族HBV的发病相关.
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环介导技术在流感检测中的应用与研究
目的 建立并应用RT-LAMP检测新甲型H1N1、季节性H1N1和季节性H3N2亚型流感病毒及乙型流感病毒.方法 通过在线软件Primer Explorer V5设计针对新甲型H1N1、季节性H1N1和季节性H3N2亚型及乙型流感病毒基因的保守区引物,建立RT-LAMP检测方法,对2012年-2013年采集的疑似咽拭子标本采用real-time PCR和RT-LAMP法检测.结果 615份标本中,real-time PCR法检出295份阳性,RT-LAMP法检出294份阳性,2种方法的检测结果差异无统计学意义(P＞0.05).2种方法所建立的季节性H1N1、季节性H3N2、新甲型H1N1、乙型的检测体系只与相应亚型流感病毒呈阳性反应,而对禽流感病毒H5、禽流感病毒H9、RSV、RV、EV71扩增结果为阴性.RT-LAMP检测方法具有良好的敏感性和特异性.结论 RT-LAMP法使用水浴锅进行等温扩增,结果在可见光或紫外灯下直接肉眼观察.RT-LAMP检测方法具有高度的敏感性、准确性、高特异性,而且简单、快速,比real-time PCR更适合应用于基层疾病预防控制中心和医院.
关键词： 流感病毒 实时定量荧光PCR 逆转录环介导等温核酸扩增技术 检测 -
KLF4、KLF6在人膀胱移行上皮癌组织中的表达及临床意义
目的:观察KLF4、KLF6在人膀胱移行上皮癌组织中的表达,并探讨其对膀胱癌发生、发展的影响.方法:采用实时定量荧光PCR技术检测49例膀胱癌手术切除标本癌组织与25例正常膀胱上皮组织内KLF4、KLF6 mRNA的表达,并分析其与患者临床病理特征的关系,采用SPSS 19.0软件进行统计学分析.结果:实时定量荧光PCR结果显示KLF4在膀胱移行上皮癌组织中的相对含量为(0.218±0.046),在膀胱正常上皮组织中的相对含量为(0.311±0.056),二者之间差异有统计学意义(P＜0.05).KLF6在膀胱移行上皮癌组织中的相对含量为(0.198±0.038),在膀胱正常上皮组织中的相对含量为(0.285±0.043),差异有统计学意义(P＜0.05).膀胱移行上皮癌组织中,KLF4与肿瘤的组织学分级、TNM分期及有无淋巴结转移有关(P＜0.05),与患者的性别、年龄无关(P＞0.05);而KLF6表达与肿瘤的TNM分期有关(P＜0.05),与肿瘤组织学分级、淋巴结转移及患者的年龄性别均无关(P＞0.05).结论:KLF4和KLF6表达降低可能与膀胱移行上皮癌的发生和浸润密切相关,通过干预KLF4和KLF6的活性可能成为治疗膀胱移行上皮癌的新靶点.
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白癜风发病与EBV、HSV-2和HCMV感染的相关性研究
目的 探讨白癜风发病与EB病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV-2)和人巨细胞病毒(HCMV)感染的关系.方法 用实时荧光定量PCR的方法,对26例白癜风患者和13例健康对照者皮肤组织标本的EBV、HSV-2和HCMV进行检测分析.结果 26例白癜风患者和13例健康对照者标本中EBV、HSV-2和HCMV检测均全部阴性.结论 白癜风发病与EBV、HSV-2和HCMV病毒感染可能没有关系.
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孕妇血浆游离DNA的定量分析
目的 探讨孕妇血浆游离DNA在唐氏筛查和非创伤性产前诊断中的价值.方法 从正常女性、孕中期孕妇、唐氏高危孕妇和孕晚期孕妇的血浆中分离游离DNA,并采用实时定量荧光PCR检测3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)及男性特有Y性别决定区基因(sex determining region Y, SRY).结果 未孕妇女、孕中期、唐氏高危、孕晚期孕妇GAPDH拷贝数均值分别为(6.40×103±1.94×103) copy/mL、(4.28×103±1.36×103) copy/mL、(3.08×104±1.67×104) copy/mL和(4.33×104±2.32×104) copy/mL;孕中期、唐氏高危、孕晚期孕妇SRY拷贝数均值分别为(174.02±98.56) copy/mL、(1065.01±588.72) copy/mL、(2627.58±1257.94) copy/mL.孕晚期和唐氏高危孕妇血浆游离DNA含量较孕中期孕妇增加(P＜0.001或P＜0.005).结论 孕妇血浆游离DNA的定量分析在唐氏筛查和无创伤性产前性别诊断中有重要的应用价值.
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子宫肉瘤组织中SULT1E1与雌激素受体蛋白的表达及其相关性
目的 探讨子宫肉瘤组织中SULT1E1与雌激素受体蛋白(ERα和ERβ)的表达水平及其相关性.方法 选择62例明确诊断子宫肉瘤患者组织为观察组,根据其病理类型,分为子宫内膜间质肉瘤(ESS)和子宫平滑肌肉瘤(UL),其中ESS 43例,UL 19例;另选取正常子宫肌层组织20例为对照组.分别采用实时定量荧光PCR和免疫蛋白印迹技术检测各组患者组织中SULT1E1、ERα和ERβmRNA蛋白相对表达水平,进一步了解各蛋白表达水平在子宫肉瘤中的相关性.结果 观察组患者组织中SULT1E1 mRNA蛋白较对照组显著降低(P<0.05),ERαmRNA蛋白较对照组显著降低(P<0.05),ERβmRNA蛋白表达水平与照组患者间未见明显差异(P>0.05).而观察组患者ESS与UL亚型SULT1E1、ERα和ERβmRNA蛋白表达水平间未见明显差异(P>0.05).在ESS组织中,SULT1E1与ERα呈负相关;在UL组织中,SULT1E1、ERα、ERβ之间均无线性相关性.结论 子宫肉瘤组织SULT1E1蛋白表达降低或缺失可能参与了子宫肉瘤的发生与发展;在子宫内膜间质肉瘤组织中SULT1E1的表达与ERα表达呈负相关,提示它们的异常表达可能与子宫内膜间质肉瘤的发生、发展有关.
