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Poly（A）加尾实时荧光定量PCR检测血清微RNA-122的表达及其临床初步应用
目的：建立Poly（A）加尾SYBR Green I实时荧光定量PCR法检测血清微RNA?122（miR?122）水平，并初步探讨其临床应用价值。方法选取2013年9月至2014年9月本院就诊的糖尿病患者和健康体检者120例为研究对象，分为糖尿病脂质代谢紊乱组（n=40）、糖尿病非脂质代谢紊乱组（n=40）和对照组（n=40）。提取血清总RNA，miR?122 Poly（A）聚合酶加尾逆转录获得cDNA，进行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增。制作C.elegans?miR?39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线定量检测血清miR?122水平，进行3组血清miR?122水平的组间比较。结果该方法可定量检测血清miR?122水平，PCR扩增产物特异性好，熔解曲线呈单峰；检测灵敏度为102拷贝/μl，检测线性范围102~107拷贝/μl。高、中、低浓度样本重复性检测的批内变异系数（CV）分别为2.23%、2.48%和2.75%，其批间CV分别为5.35%、5.88%和5.72%，显示该方法具有较好的重复性和稳定性。该方法检测糖尿病脂质代谢紊乱组、糖尿病非脂质代谢紊乱组和对照组的血清miR?122水平分别为（4.85±3.68）×103拷贝/μl、（3.06±1.86）×103拷贝/μl和（1.03±0.82）×103拷贝/μl，糖尿病脂质代谢紊乱组血清miR?122水平高于糖尿病非脂质代谢紊乱组和对照组（均P<0.01），糖尿病非脂质代谢紊乱组血清miR?122水平高于对照组（P<0.05）。结论成功建立Poly（A）加尾SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测血清miR?122水平，该方法的灵敏度高、特异性和重复性均较好。
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空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法的研究
目的 建立一种快速廉价的检测空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR方法. 方法 根据空肠弯曲菌flaA、gyrA基因设计引物,建立空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法. 结果 以flaA基因引物对空肠弯曲菌DNA进行实时荧光定量PCR,扩增曲线呈S形指数增长,大肠埃希菌等对照菌扩增阴性.方法的灵敏度为10 CFU/ml菌悬液. 结论 建立的空肠弯曲菌荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、准确等特点,具有一定的使用价值.
关键词： 空肠弯曲 SYBR Green I 荧光定量PCR -
应用SYBR Green I荧光定量RT-PCR测定糖尿病大鼠肾皮质TGF-β1表达水平
SYBR Green I荧光定量RT-PCR法检测正常、糖尿病和牛磺酸治疗组大鼠TGF-β1 mRNA /β-actin mRNA比值为(7.0±0.8)×10-3,(64.4±8.0)×10-3和(16.7±2.0)×10-3;终点法RT-PCR检测比值分别为0.28±0.12,0.58±0.16和0.43±0.10.与终点法RT-PCR相比,TGF-β1 mRNA SYBR Green I荧光定量RT-PCR实时检测法,方便快捷,敏感特异.
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利用荧光定量聚合酶链反应检测小鼠纹状体中Per1基因的表达规律
目的建立定量检测Per1 mRNA表达水平的系统,并检测小鼠纹状体中该基因的表达规律.方法提取小鼠纹状体总RNA,用Per1基因特异性引物进行聚合酶链反应(PCR),以荧光染料SYBR green I法进行实时检测.结果确定了Per1基因荧光定量的扩增和检测参数.证明在此条件下无非特异扩增,并且扩增效率在90%以上.利用此检测体系发现小鼠纹状体内Per1基因的表达呈节律性波动.结论所建立的方法能够定量测定Per1 mRNA表达水平,具有灵敏度高,线性范围广的特点.纹状体中Per1基因表达的节律性波动提示黑质纹状体系统间的相互调节可能具有昼夜节律性差异.
关键词： Per1 实时定量RT-PCR SYBR Green I 纹状体 -
实时定量RT-PCR方法检测豚鼠TSHR免疫BALB/c小鼠甲状腺TSHR的表达
目的:建立外标准法SYBR GREEN I实时定量(real-time)RT-PCR方法,以检测豚鼠TSHR分子免疫对BALB/c小鼠甲状腺TSHR mRNA的表达的影响.方法:取正常BALB/c小鼠甲状腺提取甲状腺总RNA,逆转录后进行PCR,得到333 bp扩增产物.经回收纯化后作为real-timePCR的标准品,稀释为106、105、104、103、102、101拷贝,制作标准曲线;并同时进行普通PCR,比较其灵敏度.优化反应条件使溶解曲线有特异扩增.检测豚鼠TSHR分子免疫的BALB/c小鼠甲状腺TSHR mRNA的表达.结果:建立的外标准法SYBR GREEN I实时定量RT-PCR方法可以灵敏的检测到10 copy的核酸,灵敏度为普通PCR的104倍;溶解曲线只有特异峰,溶解温度为82.9℃.没有明显的引物二聚体和非特异峰出现.不同标准点批间变异系数范围为5.8%～14.3%(n=6).与对照组比较,TSHR大分子免疫的BALB/c小鼠甲状腺组织TSHR mRNA水平显著升高(P＜0.05).结论:外标准法SYBR GREEN I实时定量RT-PCR具有灵敏度高,特异性强,重复性好的特点,比普通PCR更精确地检测出小鼠甲状腺组织TSHR mRNA的水平.
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荧光实时定量 PCR 检测 STAT 6圈套寡核苷酸对支气管哮喘小鼠脾淋巴细胞转录IL-4 mRNA 的影响
目的：研究STAT6圈套寡核苷酸（ODN）对支气管哮喘（简称哮喘）小鼠脾淋巴细胞转录IL‐4 mRNA的影响作用。方法实验细胞分组：空白组（A组）、哮喘OVA组（B组）、治疗哮喘OVA组（C组）、干扰哮喘OVA组（D组）、脂质体哮喘OVA组（E组）。设计并人工合成STAT6圈套ODN及无序ODN ，全硫代修饰的ODN。用OVA和氢氧化铝复制哮喘模型，用淋巴细胞分离液分离小鼠脾淋巴细胞，体外培养后，导入由阳离子脂质体2000转染剂携带的圈套ODN进入淋巴细胞培养，抽提RNA进行反转录，建立实时荧光聚合酶链反应（PCR）反应条件，通过比较ct进行基因表达的相对定量分析。观察圈套ODN的转染对脾淋巴细胞转录IL‐4 mRNA的影响。结果 A、B、C、D、E组的IL‐4 mRNA分别表达为：0．02545±0．00433，0．06742±0．00128，0．03151±0．00530，0．06504±0．00775，0．05952±0．00561。A组和C组低于B组、D组和E组，其差异有统计学意义（ t＝6．204，P＜0．01），C组和A组间差异无统计学意义（t ＝1．310，P ＞0．05），B组和D组、E组之间的差异无统计学意义（P ＞0．05）。结论熔解曲线分析结果证明了PCR反应的特异性，应用SYBRG reen I实时荧光PCR可以特异、准确地分析STAT6圈套ODN能下调STAT6活性，降低转录IL‐4 mRNA的表达。
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两种实时定量PCR方法检测系统性红斑狼疮患者DNA甲基化状态的比较研究
目的:应用两种不同方法检测系统性红斑狼疮(SLE)患者CD4~+T细胞p16基因甲基化状态,比较两种检测方法的差异.方法:采用以Taqman探针为基础的MSP法(方法1)和以SYBR Green I为基础的MSP法(方法2)分别检测40例SLE患者和20例正常人CD4~+T细胞中p16基因启动子区甲基化状态.结果:Taqman探针方法的结果为:SLE患者CD4~+T细胞p16基因甲基化阳性率(35.7%,10/28)高于对照组(10%,2/20),两者比较差异有统计学意义(χ~2=4.11,P＜0.05).SYBR Green I方法的结果为:患者组和对照组的CD4~+T细胞的p16基因均呈高甲基化状态,应用t检验分析发现P＞0.05,二者无统计学差异.结论:Taqman探针法消除了引物二聚体和非特异性扩增对试验结果的影响,提高了结果的特异性和准确性,被证明是进行DNA甲基化状态检测的可靠方法.
关键词： 甲基化 实时定量PCR TaqMan探针 SYBR Green I -
SYBR Green I实时定量逆转录PCR方法的建立及检测乳腺组织hMAM mRNA的表达水平
目的 建立1种简便、有效的SYBR Green I实时定量逆转录PCR(SYBR Green I Q-RT-PCR)方法检测乳腺癌组织、癌旁乳腺组织人乳腺珠蛋白(hMAM)mRNA表达水平.方法 对SYBR Green I Q-RT-PCR检测乳腺癌细胞株MDA-MB-231表达hMAM mRNA的反应条件进行优化,初步检验该方法的重复性、灵敏性.应用该方法检测11例健康志愿者外周血hMAM mRNA表达,检验该方法的特异性,并对10例乳腺癌组织、10例对应癌旁乳腺组织hMAM mRNA表达水平进行测定.结果 SYBR Green I Q-RT-PCR可重复检出乳腺癌细胞株MDA-MB-231极低表达hMAM mRNA,CT值为34.45～34.67,变异系数(CV)=0.25%.健康志愿者外周血中hMAM mRNA均阴性.乳腺癌组织hMAM mRNA阳性率为80.0%(8/10),其中Ⅰ期1例(100.0%),其量为37800;Ⅱ期6例(100.0%),量为100.4(中位);Ⅲ期1例(33.3%),量为2.94.结论 建立的SYBR Green I Q-RT-PCR方法具有简便、特异、重复性、灵敏度好、定量结果可靠、直观等优点,应用于乳腺癌组织和癌旁乳腺组织hMAM mRNA的定量检测是理想的.
关键词： 乳腺肿瘤 hMAM基因 逆转录聚合酶链反应 SYBR Green I -
人线粒体DNA荧光定量PCR检测方法的建立
建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人线粒体DNA的方法.选取人线粒体DNA高度保守基因片段,将该基因片段与pCF-T载体连接后,转化入E.coli DH5a,提取重组质粒PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR-Green I荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线.结果表明:构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含101～108拷贝时,扩增反应CT值与拷贝数的对数成线性关系),相关系数为0.997.批内和批间重复性测定的变异系数分别为1.23%～3.29%以及3.10%～5.21%.我们成功建立了实时荧光定量PCR检测人线粒体DNA的方法,该方法可作为进一步研究线粒体DNA的方法,在相关疾病诊断和监测中具有一定的应用前景.
关键词： SYBR Green I 荧光定量PCR 线粒体DNA 聚合酶链反应 人 -
荧光SYBR Green I染色及银染方法在定量聚合酶链反应诊断21-三体综合征中的比较
目的比较SYBR Green I染色及银染方法在定量聚合酶链反应(Q-PCR)诊断21-三体综合征(21-三体)中的优劣.方法 PCR扩增26例21-三体及20例正常人DNA,分别用琼脂糖电泳-SYBR Green I染色及聚丙烯酰胺凝胶-银染方法检测,进行光密度定量分析及比较.同时以细胞遗传学核型分析作对照.结果两种方法检测DNA均于24个PCR循环时显带清晰;定量分析结果同核型分析结果一致;SYBR Green I染色历时30 min,而银染则历时4～5 h.结论在Q-PCR中SYBR Green I染色敏感度同银染,较银染更简单、省时、经济.
关键词： SYBR Green I 银染 定量聚合酶链反应 检测 21-三体综合征 -
应用SYBR Green I荧光染色同源基因定量聚合酶链反应快速诊断21-三体综合征
目的建立一个快速、准确诊断21-三体综合征(21-三体)方法.方法取26例21-三体患儿及20例正常人DNA标本,引用一对引物同时PCR扩增两个同源基因片断:21号染色体长臂的人肝型磷酸果糖激酶基因(PFKL-CH21)及1号染色体的人肌型磷酸果糖激酶基因(PFKM-CH1),用SYBR Green I荧光染色,琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像系统分析软件测光密度进行定量分析.结果 24个PCR循环检测两个同源基因扩增产物光密度之比:病例组为1.61±0.18;正常人组为1.01±0.06,两组比值分布无重叠区,诊断结果与染色体核型分析一致,约4 h可完成.结论 SYBR Green I荧光同源基因定量PCR方法省时、简单、快捷、准确诊断21-三体,为临床及产前诊断21-三体提供一种新的诊断方法.
关键词： 21-三体综合征 诊断 荧光 SYBR Green I 同源基因定量聚合酶链反应 -
荧光染料SYBR GreenⅠ及EB在定量PCR中敏感性比较
目的:比较荧光染料SYBR Green I及EB在定量PCR诊断中检测DNA的敏感性.方法:分别用琼脂糖凝胶电泳SYBR Green I染色及EB染色,检测26例21-三体综合征患者及20例正常人DNA PCR扩增产物,并进行光密度分析比较.结果:SYBR Green I染色于24个循环PCR产物带型清楚,可准确定量检测;EB染色则在28个循环才能进行定量分析.结论:荧光染料SYBR Green I染色较EB染色测量DNA敏感、快捷,在定量PCR技术中值得推广应用.
关键词： SYBR Green I EB 定量PCR -
PD-L1基因实时荧光定量RT-PCR法的建立及在大鼠肝移植中的应用
目的 建立real-time RT-qPCR(实时荧光定量RT-PCR)检测大鼠PD-L1的方法,应用该方法检测大鼠移植肝中PD-L1 mRNA的水平.方法 两袖套法复制大鼠肝移植耐受组(BN→BN)及排斥组( LEW→BN)模型,术后7d处死受体,检测肝功能ALT和AST水平,HE染色病理分析排斥程度,Trizol法提取移植肝总RNA并反转录为cDNA;选β-actin作为内参,复制SYBR Green I real-time RT-qPCR检测法.利用该方法检测移植肝中PD-L1和β-actin的初始模板量,PD-L1/β-actin计算PD-L1 mRNA的相对表达量.结果 异基因LEW→BN组出现急性排斥反应,ALT、AST排斥组均高于耐受组(均P＜0.05).RAI评分排斥组高于耐受组(均P ＜0.05).PD-L1扩增效率为98.8％,相关系数为0.996；溶解曲线为特异单峰；变异系数小于2.0％；移植肝中PD-L1 mRNA相对表达为耐受组[(0.95±0.10)×10-2]高于排斥组[(0.81±0.09)×10-2],差异有统计学意义(t=2.62,P=0.026).结论 成功建立了大鼠源PD-L1的real-time RT-qPCR检测方法,耐受组PD-L1的高表达提示其可能有利于大鼠移植肝的存活,为研究肝移植免疫耐受奠定了理论基础.
关键词： 肝移植 PD-L1 实时荧光定量RT-PCR SYBR Green I -
SYBR Green I荧光PCR检测登革热病毒基因方法的建立
目的 建立SYBR Green I荧光PCR快速检测登革热病毒的方法.方法 以通用引物对标准株提取物和血清样本进行耵-PCR扩增,同时以SYBR Green I标记进行实时PCR扩增,分析其灵敏性特异性和重复性.结果 标准毒株的扩增结果与预期结果相同,测序结果显示实验结果序列与标准株序列一致.实验的灵敏性特异性和重复都较高.结论 SYBR Green I荧光PCR检测登革热病毒的方法是一个快速、准确检测登革热的方法,但它更适用于早期传染病监测.
关键词： 登革热病毒 PCR SYBR Green I -
实时荧光定量RT-PCR检测肺癌中PUMA mRNA的表达
目的 建立检测肺癌PUMA mRNA的实时荧光定量RT-PCR方法,初步探讨PUMA mRNA表达水平与肺癌发生发展的关系.方法 以GAPDH作为内参照基因,应用实时荧光定量RT-PCR,检测PUMA mRNA在肺癌组织中的表达水平.结果 建立了应用实时荧光定量RT-PCR检测肺癌PUMA mRNA的方法.熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳结果证实了PCR反应的特异性;相对定量结果显示,40例肺癌患者的肿瘤组织、对应的癌旁组织、远癌组织和10例肺良性病变组织中均有PUMA tuRNA的表达,表达水平在肺癌与肺良性病变之间、肺癌各病理类型之间差异均无统计学意义(P>0.05).结论 应用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR可以特异、准确、快速地分析不同肺组织中PUMA mRNA的表达差异.非小细胞肺癌的发生发展与PUMA mRNA的表达无明显相关性.
关键词： PUMA 实时荧光定量RT-PCR 肺癌 SYBR Green I
