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浙江省检出带毒力基因的人源性肠出血性大肠杆菌O157:H7
目的了解肠出血性大肠杆菌O157:H7在浙江省人群中的感染情况和菌型分布特征,制定相应的防治对策.方法5～10月份肠道传染病高发季节,在浙江省各地(市)肠道门诊采集腹泻病人粪便,对O157:H7菌株进行分离培养,并用PCR方法检测其毒力基因.结果1998年开始至今的人群监测中,共检出2株无毒力的肠出血性大肠杆菌O157:H7.PCR毒力基因检测,SLT2和Hly阳性,SLT1阴性.结论与以往不同,此次分离到带有毒力基因的人源性肠出血性大肠杆菌O157:H7,说明浙江省O157:H7在菌型特征方面发生了变化,对人群健康构成了更大的威胁.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157 H7 毒力 分离 -
用PCR-ICT方法检测肠出血性大肠杆菌O157
目的 初步建立肠出血性大肠杆菌O157的聚合酶链式反应-免疫层析检测(PCR-ICT)技术.方法 根据肠出血性大肠杆菌O157的溶血性基因(hlyAB)序列设计特异性引物和探针,并分别经生物素和地高辛标记,用胶体金免疫层析技术检测PCR扩增产物.结果 用建立的PCR-ICT方法检测5株O157:H7血清型大肠杆菌均得到阳性结果,检测5株非O157血清型普通大肠杆菌和5株其他肠杆菌茵株均得到阴性结果,检测冻虾仁、冻贝肉、冻鸡肉、冻猪肉等出口食品样品43份,未检出肠出血性大肠杆菌O157,与PCR-凝胶电泳和分离培养法检测结果一致.结论 用金标免疫层析方法检测PCR产物,其灵敏度基本与电泳法相当.初步应用表明PCR-ICT方法简便具有快速、易操作、检测时间短、简便等特点.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157 PCR 免疫层析试验 溶血性基因片段 -
使用环介导等温扩增技术快速检测食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的初步研究
目的 探索建立一种快速、简单的食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测方法.方法 针对编码O157:H7脂多糖的rfbE基因(GenBank S83460)和编码H7鞭毛抗原的fliC基因(GenBank L07388)特征性保守序列,利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)核酸扩增基因技术,对21株O157:H7和非O157:H7菌株进行特异性检测,并与聚合酶链式反应方法进行比较.同时使用部分食品样品对LAMP法检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的实际运用价值进行评估.结果 LAMP法可以在1h内完成检测工作.LAMP法检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的灵敏度为96.72%,特异度为85.71%,准确性为93.26%.结论 LAMP检测技术的灵敏度较聚合酶链式反应技术高.LAMP是一种简单、快速的检测技术,适用于筛选可疑大肠杆菌O157:H7样本.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157 H7 环介导等温扩增 rfbE基因 fliC基因 -
肠出血性大肠杆菌O157胶体金免疫层析试纸条的研制
目的 建立一种简便实用的胶体金免疫层析检测方法用于食品样品中肠出血性大肠杆菌O157的快速筛查.方法 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,以抗EHEC O157 LPS单克隆抗体标记,以兔抗O157多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜作为捕获抗体,利用双抗夹心法,制成O157胶体金免疫层析检测试纸条,并进行了特异性和敏感性试验.结果 该试纸条仅与O157反应,与其他受试菌株均不反应.检测敏感性为106CFU/mL,对人工污染 EHEC O157 模拟牛肉样品增菌后检测,敏感性为56 CFU/g.结论 成功研制出 EHEC O157 胶体金免疫层析试纸条,敏感性高,特异性强,检测速度快,10min可出结果,操作简便,可用于现场大量样品的检测.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157 胶体金 免疫层析 检测 -
EHEC O157∶H7基因缺失突变株口服免疫小鼠的实验研究
目的研究肠出血性大肠杆菌O157∶H7基因缺失突变疫苗候选株EHEC 86-24(Δstx/ler)的安全性和免疫保护效果,为进一步的临床实验提供依据.方法对出生7d昆明鼠经口服途径进行免疫,分别在一次免疫和加强免疫14d后以O157∶H7强毒株EDL933 (NalR)攻毒,观察小鼠的发病情况、疫苗候选株的保护率及攻毒后的带菌消长情况.同时又作了被动免疫实验,成年母鼠间隔14d口服免疫两次,所生乳鼠7d攻毒.结果疫苗株以10倍于强毒株小致死剂量口服接种无致病作用.疫苗株一次免疫保护率可达60%.因小鼠的易感性随日龄和体重的增加而降低,加强免疫后,对照组未能全部致死(死亡40%),而免疫组全部存活;攻毒后免疫组比对照组排菌时间显著缩短(24h/216h).两次口服免疫后血清IgG抗体效价达1∶1600.被动免疫保护率100%.结论该突变株通过口服接种能够引起特异性免疫应答反应,具有良好的免疫原性和免疫保护作用.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157 免疫 小鼠 -
肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位Stx2A的表达与纯化
目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7志贺样毒素A亚单位(Shiga-like toxin,Stx2A),并对其初步纯化.方法设计引物采用PCR法自EHEC O157:H7基因组扩增Stx2A的编码基因stx2a,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11c(+)-stx2a,经测序鉴定后转化E.coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDSPAGE和Westen blot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白.结果扩增的stx2a基因约950bp;原核表达质粒pET-11c(+)-stx2a经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli.BL21(DE3)中得到高效表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约31×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达92.3%.结论EHEC O157:H7 Stx2A的高效表达与初步纯化,为探讨O157:H7菌的感染机制奠定基础.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157 H7 毒素A亚单位 表达 纯化 -
郑州市肠出血性大肠杆菌O157:H7感染监测
[目的]2005年监测郑州市肠出血性大肠杆菌O157:H7感染状况及病原分布特点,为各级卫生行政部门制订新发传染病防治措施,提供基础疫情资料.[方法]监测标本用免疫磁珠集菌方法(IMS)做病原学分离培养、毒力基因检测用多重PCR方法、药敏试验用(K-B)常规方法.[结果]腹泻病人标本185份,大肠杆菌O157:H7检出阳性4份.外环境标本588份,检出大肠杆菌O157:H7阳性20份.用多重PCR方法做毒力基因检测,有6份家畜家禽阳性标本中检出O157:H7毒力基因(Stx2、eaeA、HIyA)为阳性.药敏试验24株肠出血性大肠杆菌O157:H7对8种抗菌药物敏感率为95%以上,对新生霉素100%耐药,其余7种对抗菌药物敏感程度各有差异.[结论]郑州市有散在的大肠杆菌O157:H7感染的病人及动物疫点.奶牛和波尔山羊是大肠杆菌O157:H7动物宿主.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157 H7 监测 免疫磁珠集菌法(IMS) 多重PCR法 药敏试验 -
类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FliC与EHEC O157:H7 EspA蛋白的融合表达及其免疫学性质研究
目的 融合表达类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FilC与肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157 EspA蛋白,并评价其免疫学性质.方法 PCR扩增类鼻疽杆菌FilC编码基因bpsl3319,连接到基于EHEC O157 EspA的表达载体pEspA上,表达并纯化EspA-FliC融合蛋白,Western blot分析其抗原性；EspA-FlC免疫Balb/c小鼠评价其免疫原性.结果 获得了bpsl3319目的基因,构建了重组表达质粒pEspA-bpsl3319；实现了EspA-FilC的高效表达,其表达量约占菌体总蛋白的25％,纯化后蛋白纯度超过85％.Westernblot结果显示EspA-FliC能分别与抗类鼻疽杆菌多克隆抗体、抗EHEC O157:H7 EspA的单抗和多抗血清发生特异性抗原抗体反应.EspA-FilC免疫Balb/c小鼠可刺激其产生高效价特异的IgG,且此抗体能识别EspA-FilC 、EspA以及天然类鼻疽杆菌的FliC.结论 重组表达了融合蛋白EspA-FilC,该蛋白具有较好的免疫反应性和良好的免疫原性.此研究为下一步研制类鼻疽杆菌和EHEC O157的二联疫苗奠定了基础.
关键词： 类鼻疽杆菌 鞭毛蛋白FliC 肠出血性大肠杆菌O157 EspA 疫苗
