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肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA-Stx2B融合蛋白的克隆、表达及生物学活性研究
目的 重组表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的EspA与Stx2B融合蛋白,并对其生物学活性进行初步研究.方法 采用PCR技术从EHEC O157:H7基因组中扩增espA基因及stx2B基因,两基因通过连接子(linker)相连,T/A法克隆,克隆至pET-28a(+)表达载体上,转化宿主细胞E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测其表达量及表达形式,免疫印迹分析免疫反应性.用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,检测其免疫原性,然后对免疫小鼠进行O157活菌攻毒试验和O157超声上清致死保护试验.结果 构建的espA-stx2B融合基因片段的测序结果 与理论预测值完全一致.融合蛋白在工程菌中以包涵体的形式表达,表达量约40%.免疫印迹显示融合蛋白能分别与EspA和Stx2B抗体发生抗原抗体反应.免疫小鼠其特异性抗体阳转率达100%,EspA和Stx2B抗体的几何平均滴度(GMT)分别增长了124.30倍和58.49倍.免疫小鼠O157活菌攻毒保护试验免疫后排菌时间和排菌量与对照组相比并没有明显改变,O157菌超声上清致死保护试验免疫组存活率为10/15,对照组全部死亡.结论 在E. coli中高效表达了EspA-Stx2B融合蛋白,此融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,融合蛋白免疫小鼠并不能降低细菌在小鼠胃肠道的黏附与定植,但却起到明显的免疫保护作用,保护率为66.7%(10/15).
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大肠杆菌O157:H7 EDL933w z3672基因缺失突变体的构建
目的:构建EHEC O157:H7 EDL933w z3672基因缺失突变体.方法:根据已知的O157:H7 EDL933基因组全序列,采用pKOBEG介导的Red重组系统,筛选卡那霉素抗性基因替换z3672基因的阳性克隆,然后FLP位点特异性重组去除两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因,后通过PCR和测序手段证实.结果:获得了z3672基因缺失而且不含有卡那霉素抗性基因的EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株.结论:为进一步研究O157:H7的致病机制奠定了基础.
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鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌体Fab抗体库的构建及筛选
目的 构建鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,并从中筛选特异性的抗体.方法 用EHECO157:H7 Stx2类毒素免疫BALB/c小鼠.取脾分离淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR分别扩增抗体轻、重链(κ和Fd)基因,经双酶切依次克隆入噬粒载体pComb3X中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13K07进行超感染,构建抗EHEC O157:H7Six2的Fab噬菌体抗体库.以纯化的Stx2为抗原进行筛选,获得抗EHEC O157:H7 Stx2的特异性Fab抗体.Western blot法检测噬菌体抗体与毒素抗原的结合活性,并对所得阳性克隆进行基因序列分析.结果 构建了一个库容为1.56×107的Fab抗体库,筛选出 3株特异性较强的阳性克隆,其中2个可与Stx2A1亚单位抗原反应,1个可与Stx2B亚单位抗原反应.基因序列分析显示,轻、重链可变区氨基酸序列与GenBank中已注册的鼠免疫球蛋白可变区氨幕酸序列同源性分别为98.5%和99.6%.结论 已成功构建了鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,为进一步制备抗EHEC O157:H7 Stx2的治疗性人源化抗体奠定了基础.
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PCR方法检测EHEC O157∶ H7的rfbO157、fliCH7、hlyA、eaeA、stx2及其变种基因
目的:应用当前国际上常用的rfbO157、fliCH7、hlyA、eaeA、stx2及其变种5对引物,对45株疑似肠出血性大肠埃希菌O157∶ H7(EHEC O157∶ H7)检测鉴定,全面了解此类菌的致病力情况.方法:分纯并富集被鉴定菌株,首先以单克隆诊断血清学凝集,阳性者再经 100℃水煮制成粗模板,应用PCR检测各菌株是否具有rfbO157、fliCH7、hlyA、eaeA及stx2及其变种5种基因,扩增结果经EB染色后在凝胶成像仪下观察特异性条带并拍照.结果:45株被检测菌经PCR扩增检测,5种基因全部阳性的有10株,4种基因出现阳性的只有1株,3种基因阳性的有6株,2种基因阳性的有17株,1种基因阳性的有10株,1株菌的5种基因检测均为阴性.45株菌中rfbO157阳性的有44株,fliCH7基因阳性的菌株有30株,hlyA阳性的菌株只有10株,eaeA阳性基因的菌株有21株,stx2及其变种阳性的也只有11株.结论:这次45株菌中有5株具有全部的5种基因,44株为EHEC O157,其中30株为EHEC O157∶ H7,这次选择的5种基因不仅能给被检测菌株定性,而且能较全面地反应其毒力强度,适合于有条件的基层实验室开展.
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A Primary Test of EHEC O104:H4and EHEC O157:H7in Certain Kinds of Food in Wuhan,China
Objective:This paper provided preliminary description of food contamination derived from Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)O104:H4 and EHEC O157:H7 in Wuhan in June 2011.Methods:47 food samples,including vegetables and meat,were subjectively sampled from some restaurants.PCR assays were used to detect EHEC O104:H4 and EHEC O157:H7.Results:The PCR results showed that none of the samples were positive for either EHEC O104:H4 or EHEC O 157:H7.Conclusion:Although large outbreaks of gastroenteritis and the hemolytic uremic syndrome caused by EHEC O104:H4 had occurred in some European countries,China has had few outbreaks associated with EHEC O104:H4.This shows that food supply is relatively safe in China.Nevertheless,many ongoing problems of food safety in China are still not solved showing the necessity of further studies on food safety.
关键词： EHEC O104 H4 EHEC O157 H7 Food Safety
