首页 > 文献资料
-
中国恒河猴SIVmac239艾滋病模型亚急性期的实验观察
目的:观察SIVmac239中国恒河猴艾滋病模型亚急性期内T淋巴细胞亚群、病毒载量指标变化情况,探讨中国恒河猴艾滋病模型亚急性期病毒学相关指标变化特征.方法:采用SlVmac239病毒株静脉接种健康中国恒河猴复制中国恒河猴艾滋病动物模型,观察猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)感染后动物模型亚急性期内T淋巴细胞亚群指标变化、病毒载量变化情况.同时记录动物模型临床症状情况.结果:健康恒河猴接种病毒株后3个月体重及BMI指数比较稳定,各时间点差异不显著,在感染第10 ～14天病毒载量达到高峰(6.72±0.44)个1g,此后整体表现为水平波动下降趋势.T淋巴细胞亚群在感染后出现显著改变,CD3,CD4,CD8计数和百分比有不同程度的变化;CD4/CD8比值感染后2周内明显下降,一般在病毒载量高峰时表现为低比值为(0.86±0.29),随后比值缓慢波动上升.感染3个月内共有3只感染猴临床症状明显,其中1只出现腹泻、2只出现摄食下降等临床症状.结论:中国恒河猴艾滋病动物模型与国外印度恒河猴艾滋病动物模型亚急性期相似,研究内容为中国恒河猴应用于艾滋病模型研究的标准化建立补充了更详尽的亚急性期变化内容.
-
表达SIV Gag/Env基因的DNA疫苗、重组腺病毒和重组痘苗病毒三载体疫苗联合免疫小鼠的细胞免疫研究
获得性免疫缺陷综合征即艾滋病是人类面临的严重公共卫生威胁,目前常用的药物疗法仍存在一定的缺陷,尚不能彻底治愈AIDS并阻断HIV的传播.将治疗型疫苗用于HIV感染的治疗具有一定的发展潜力,但缺乏适宜的HIV感染动物模型阻碍了治疗型HIV疫苗的研制.SIV能够感染非人灵长动物并引起类似AIDS的猴免疫缺陷病,因而常被用作研究HIV及其疫苗的替代动物模型.为了对SIV疫苗在猴感染模型中治疗SIV感染的效果进行评价,我们分别构建了表达SIV gag和env基因的DNA疫苗、重组腺病毒和重组痘苗病毒疫苗,并联合使用这三种疫苗免疫小鼠,对包括不同抗原组合、不同免疫次序及间隔的免疫策略进行探索和优化.IFN-γ酶联免疫斑点和小鼠体内杀伤试验的结果显示,通过三载体疫苗联合免疫,能够在小鼠体内诱导出强度较高、持续时间较长的SIV Gag/Env特异性细胞免疫反应.并且,重复免疫后仍可以诱导较高水平的免疫反应.该结果为在SIV感染猴模型中评价多载体疫苗序贯和重复免疫治疗SIV感染的研究奠定了基础,也为治疗型HIV疫苗的研究提供了参考.
-
HIV-1动物模型及跨物种感染的研究进展
人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种感染人类免疫系统细胞、导致获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的慢病毒,其中HIV-1是导致AIDS全球流行的主要病原体.本文简要综述了HIV-1感染的黑猩猩和平顶猴、SIV与SHIV感染的猴、stHIV-1和HSIV感染的猕猴等非人灵长类动物模型,以及HIV-1感染的嵌合体鼠、HIV-1感染的兔和HIV-1感染的转基因鼠等非灵长类动物模型,并分析了各类模型的特点.对于HIV-1跨物种感染所面临的种族屏障和关键点的研究进展亦作了论述,分析了HIV 1感染的鼠类跨种族模型的进展情况,以促进HIV-1的发病机制、药物疗效和疫苗制备等研究.
-
实时荧光定量RT-PCR监测恒河猴体内人/猴免疫缺陷病毒载量在传代过程中的变化
目的 为分析中国SHIV/猕猴AIDS模型的病毒载量变化趋势,建立一种实时、灵敏、特异的针对人/猴免疫缺陷病毒的定量检测方法.方法 体外转录制备RNA标准品,利用TaqMan EZRT-PCR试剂盒的反应体系和针对SHIV gag保守区91个碱基的TaqMan探针和引物,建立一步法实时荧光定量RT-PCR.提取126份来自SHIV-CN97001感染恒河猴血浆病毒RNA并定量检测.结果 利用梯度稀释的RNA标准品对反应体系进行优化,标准曲线下限达到2×102 拷贝/ml,相关性(r＞0.99)及重复性(CV=4.14%)均能达到测定要求.病毒载量的检测结果表明SHIV-CN97001在猴体内传代过程中病毒载量有先升后降的趋势,病毒载量通常在接种病毒或感染猴的全血后第14天达到高峰.血浆载量可达到105～106 拷贝/ml.结论 成功地建立了一步法定量SHIV RNA的实时荧光定量RT-PCR,为SHIV/恒河猴AIDS模型的建立与应用提供了灵敏的病毒载量检测方法.SHIV-CN97001的体内繁殖能力在猴体内传代过程中有所增强.
-
A/H1N1流感的流行特点及防治
2009年3月底至今,墨西哥、美国等地接连暴发新型A/H1N1流感病毒(早期也称为猪流感病毒(Swine Influenza Virus,SIV)疫情,已造成超过177人死亡,不但放缓了全球经济复苏的脚步,更为严重的是造成越来越多的人面临死亡的威胁,并引起了人们对新型流感病毒的巨大恐慌.本文对A/H1N1型流感的概况、公共卫生等方面进行阐述,使人们对流感病毒有一定的认识,在提高自我保护意识的同时去除不必要的担心.
-
CEMx174细胞中 SAMHD1蛋白表达与SIVmac239病毒水平的相关性研究
目的：研究SIV在感染CEMx174细胞过程中，SAMHD1在基因和蛋白水平的变化与病毒水平之间的相关性。方法 SIVmac239病毒感染CEMx174细胞后，每天收集上清和细胞，应用TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法，检测细胞内SAMHD1 mRNA的相对表达量的变化；用Western blot检测SAMHD1蛋白与SIVmac239 P27蛋白表达量的变化，并分析其相关性。结果 CEMx174细胞感染SIVmac239后，细胞中的SAMHD1 mRNA基于内参基因GAPDH的相对表达量逐渐增加，前3 d分别增加了14％，16％，42％，随后开始迅速增加，第4天达到了200％，第6天更是达到了890％；细胞中SAMHD1蛋白的表达量在感染后第1、2天时变化不大，随后逐渐降低，到第5、6天时，几乎检测不到，呈现逐渐下降的趋势。结论 CEMx174细胞感染SIVmac239后，SAMHD1基因表达上调，与上清中病毒载量水平正相关，细胞内SAMHD1蛋白水平与SIVmac239 P27蛋白水平呈负相关。
关键词： SAMHD1 HIV-1 SIV 实时荧光定量RT-PCR -
TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法检测SIV/SHIV病毒RNA拷贝数方法的建立
目的 建立TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)及SHIV病毒的RNA拷贝数.方法 利用TaqMan探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,通过对本室SIV/SHIV病毒RNA定量外标准品RS的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性.结果 该方法检测灵敏度可达4.60×101 copies/ μL,特异性及重复性良好,对同一样品进行16次重复检测,其循环阈值的平均标准偏差为0.066 .结论 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)及SHIV病毒RNA载量.
关键词： SIV 病毒载量 实时定量RT-PCR TaqMan探针 -
猴免疫缺陷病毒衣壳蛋白p27在大肠杆菌中的表达及纯化
目的 获得用于SIV检测的衣壳蛋白p27重组抗原.方法 利用生物信息学软件选择衣壳蛋白p27抗原表位集中的区域,合成SIV p27基因;将该基因与pMAL-p5x载体连接构建pMAL-p5x-p27重组质粒,并转化大肠杆菌BL21中,诱导表达;用Amylose Resin亲和层析柱对表达产物进行纯化.结果 SDS-PAGE分析显示,pMAL-p5x-p27重组质粒可在大肠杆菌中高效表达,表达产物分子量约为70×103;经纯化获得目的 蛋白p27纯度可达90%.结论 本研究利用原核表达系统成功表达了SIV p27蛋白,为SIV检测方法的建立奠定了基础.
-
游离SIVmac239病毒与T细胞介导两种方式感染内皮细胞的效果比较
目的：比较游离病毒感染与T细胞介导的感染方式对SIV感染内皮细胞的影响，探索SIVmac239感染内皮细胞的主要途径，从而为SIV入侵血脑屏障的机制提供理论基础。方法采用游离SIV病毒直接感染内皮细胞和 SIV 感染的 CEMx174细胞与内皮细胞共培养的两种方式，通过巢式 PCR、间接免疫荧光法、Western blotting以及ELISA检测内皮细胞的感染程度。结果两种感染方式都能在内皮细胞内检测到前病毒DNA，感染细胞与内皮细胞共培养时，内皮细胞内前病毒DNA含量，SIV P27蛋白表达量和细胞培养上清液中P27含量远高于游离病毒直接感染的方式。结论细胞介导的感染方式相较于游离病毒直接感染方式对内皮细胞的感染能力更强，可能是SIV病毒入侵血脑屏障的主要途径。
-
恒河猴艾滋病模型中枢神经系统及淋巴结病变的电镜观察
目的 观察恒河猴艾滋病模型不同感染阶段中枢神经系统及淋巴结的超微结构改变,探讨艾滋病的发病机制和病理改变的发展过程.方法 15只恒河猴,1只为正常对照,其余14只静脉注射感染SIVmac239猴艾滋病病毒,分别于感染后1周,2周,1个月,2个月,12个月,18个月取腹股沟淋巴结及下丘脑组织进行透射电镜检查.结果 感染后1周即可出现淋巴结内淋巴细胞病变,表现为线粒体肿胀,嵴溶解,出现自噬体等.感染后2周及1个月时淋巴细胞病变主要表现为线粒体肿胀,嵴溶解;感染2个月时淋巴细胞细胞核形态出现明显改变.感染后12个月淋巴结内多数淋巴细胞出现病变,细胞肿胀,细胞器正常形态大部分消失;部分细胞出现溶解性坏死的特征.至感染后期(18个月时),淋巴结内局部淋巴细胞稀疏,细胞核肿胀或形态不规则.中枢神经系统的病变在感染后1周出现,表现为神经纤维肿胀,感染后2周出现神经元的病变,表现为神经元线粒体肿胀,粗面内质网脱颗粒,尼氏体消失;神经纤维内出现空泡.感染后12个月及18个月时,神经元和神经纤维的病变加重.结论 在SIV感染早期,淋巴结内淋巴细胞及中枢神经系统即可出现病变,维持一段相对稳定的时间后,至疾病后期,病变加重.中枢神经系统与淋巴结的超微结构病变发展规律有一定的相似性.
-
ELISPOT方法检测SIVmac239感染猴特异性细胞免疫水平
目的 为了完善现有的SIV/恒河猴模型,掌握恒河猴被SIV感染后体内细胞免疫应答状态,为评价HIV疫苗提供方法和数据上的参考,我们测定了SIV感染猴体内病毒特异性的细胞免疫水平.方法 实验前选出4只无SIV、STLV、SRV/D和B病毒感染的恒河猴,用SIVmac239病毒液静脉感染实验猴,使用RT-PCR、流氏细胞术和ELISPOT等方法,监测SlVmac239病毒在恒河猴体内复制情况、感染猴的外周免疫损伤情况和细胞免疫情况,持续测定一年.结果 实验结果显示IFN-γ ELISPOT方法能有效的评估实验猴的细胞免疫情况,IFN-γ ELISPOT结果和CD4+T细胞数无相关性,与血浆病毒载量稍有相关.结论 本实验明确了SIVmac239感染中国恒河猴体内CTL的基本趋势和范围,了解了外周血病毒载量、外周免疫损伤与细胞免疫状况之间的联系,完善了SIV/SAIDS模型评价指标,为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了基础条件.
-
食蟹猴体内、外感染SIVmac251后产毒水平的比较研究
目的探索在猴免疫缺陷病毒(SIV)造模之前选择适宜于制作此模型的猕猴个体的方法,以减少感染后血浆病毒水平过低的几率,从而保证实验的质量.方法测定SIV感染前实验猴外周血单个核细胞(PBMC)在试管内感染SIV后的产毒水平,并与该个体在感染同一株SIV后血浆病毒载量的水平进行比较分析,判断此法能否用于选择适于造模的实验猴.结果根据14只食蟹猴的结果,体外与体内的病毒水平符合比为10/14,体内病毒载量偏低的猴6只(6/14),体外病毒水平偏低者4只,如把这4只猴排除,则余下10只猴体内病毒载量偏低的猴为3只(3/10).结论应用检测体外PBMC病毒产量水平的方法,选择病毒水平高的猴才用于体内感染SIV.这样能部分去除体内感染的病毒载量偏低的猴.但终的解决方法仍是建立培育遗传背景清楚的SPF实验猴群.
-
SIVmac251不同途径感染恒河猴急性期实验研究
目的 建立SIV黏膜感染的恒河猴模型,并与静脉感染相比较,研究不同途径感染后病程进展是否存在差异. 方法 用SIVmac251经静脉、阴道、直肠3种途径分别感染恒河猴,定期采血,进行全血病毒分离,测定血浆病毒载量、CD4+/CD8+比值及抗体检测. 结果 感染后7 d至目前56 d为止,外周血单核淋巴细胞中前病毒DNA检测、全血病毒分离全部呈现阳性,只有直肠感染猴S172在7 d和42 d时出现较高病毒滴度;血浆病毒载量检测阳性出现先后顺序为静脉感染、直肠感染、阴道感染,14 d达到高峰,然后迅速下降,变化趋势基本保持一致.血浆抗体检测从第14天开始3种途径感染的恒河猴体内抗体均为阳性;感染后CD4+/CD8+比值下降,在第28天时出现比例倒置.结论 经不同途径均成功感染恒河猴后在病毒分离和血浆病毒载量等方面表现出了一定的差异.
-
肠道嗜性和神经嗜性 SIV 毒株 Gp120序列变异特点的比对分析
目的：研究SIVmac239在不同中国恒河猴体内由于免疫压力出现的病毒Env区的变异进化情况。比对分析可形成AIDS相关肠病和脑病的SIV病毒其Gp120序列的差异及特点。方法四株SIVmac239感染晚期发病恒河猴PBMC中分离的病毒及两株神经嗜性SIVmac251病毒，通过有限稀释分离培养病毒单克隆，提取病毒RNA后反转录，PCR扩增病毒gp120序列进行系统进化树分析。同时分析两组不同嗜性毒株Gp120氨基酸序列及糖基化位点的变化情况。结果 SIVmac239在四只恒河猴体内发生不同的变异进化。肠道嗜性毒株与神经嗜性毒株氨基酸序列的差异集中在V1和V4区，肠道嗜性毒株在V4区与一个糖基化位点的增加，而神经嗜性毒株的糖基化位点的变化都发生在保守区C1、C2和C3。结论 SIV肠道嗜性和神经嗜性的增强分别与包膜蛋白Gp120上V4区糖基化位点的增加和C1区的糖基化位点缺失相关，两种嗜性的差异并不表现在与嗜性形成有紧密联系的V3区上。
-
SIVmac239病毒经不同途径感染恒河猴急性期CD4+T细胞数量与其细胞表面CD95表达量的变化关系
目的 研究SIVmac239病毒分别通过直肠(rectal infection:IR)及静脉(intravenous infection:IV)感染恒河猴,在感染急性期外周血CD4+T细胞数量与其细胞表面的死亡受体(CD95)表达量之间的变化关系.方法 将SIVmac239经直肠及静脉途径各感染14只恒河猴.监测病毒载量、CD4+ T淋巴细胞数量及CD4+/CD8+比值的变化,从而明确感染.同时,在感染急性期内9个时间点采集静脉血,并利用流式细胞术分析CD4+T细胞表面CD95的表达量.结果静脉组恒河猴CD95表达量于第2天开始升高,第7天达到高,同时CD4+T淋巴细胞数降到低.直肠组恒河猴也于感染后第2天开始升高,但第10天才达到高值,CD4+T淋巴细胞数于第17天降到低.同静脉组相比,直肠组CD95表达量增高及CD4+T细胞数降低均较晚出现,且其CD4+T细胞数量降至低晚于CD95表达量达到峰值一周后出现.结论 SIVmac239经直肠及静脉感染恒河猴后,伴随CD4+T细胞表面CD95表达的升高,CD4+T细胞数量逐渐下降.但不同感染途径对CD4+T细胞表面CD95的表达量与CD4+T淋巴细胞数的变化不尽相同,这可能由于不同感染途径造成CD95在感染急性期CD4+T细胞数量降低中发挥的作用不同.
-
SIV p27单克隆抗体的制备和鉴定
目的建立SIV p27杂交瘤细胞株,并对其分泌的SIV p27单克隆抗体进行初步鉴定.方法使用基因重组的SIV p27蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术使用半固体培养基法建立杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体.通过染色体核型对杂交瘤细胞株进行鉴定;采用Western blot、免疫荧光法、酶联免疫吸附法确定单克隆抗体的交叉反应性、相对亲和力、抗原识别表位、免疫球蛋白的类型和亚类,对单克隆抗体进行鉴定.结果获得4株可稳定分泌SIV p27单克隆抗体的杂交瘤细胞,1C3、2B6为IgG1类,2E12为IgG2b类,3G3为IgG2a类.4株单抗均能识别SIV的p27蛋白,与逆转录病毒SRV、STLV无交叉反应,2B6、2E12与HIV p24有交叉反应.免疫荧光法检测腹水效价为1:10240～1:40960.1C3、2B6、2E12、3G3染色体平均数分别为103、97、96、101.2E12与3G3识别不同的抗原表位.结论成功地制备出4株SIV p27单克隆抗体,均具有良好的特异性和亲和力,为进一步建立免疫分析方法,进行SIV/SAIDS及其艾滋病相关研究,奠定了基础.
-
SIV感染受体研究进展
猴免疫缺陷病病毒(Simian Immunodeficiency Virus,SIV)感染猿猴是理想的研究人类艾滋病的动物模型,它可以帮助我们认识艾滋病的病程进展,更重要的是它可以作为药物及疫苗作用效果的评价工具.现在,对于艾滋病治疗,已经有很多研究将治疗的靶位点放在了病毒利用辅助受体方面.本文主要总结了近年来有关SW感染所利用的辅助受体以及这些受体对于病毒亲染嗜性的影响.
-
SIVmac239对恒河猴B淋巴细胞生长繁殖的抑制作用
目的探讨恒河猴免疫缺陷病毒SIVmac239感染CD4+T淋巴细胞后可否产生某些抑制B淋巴细胞的生长活性因子,为HIV/AIDS进一步的病原学研究和控制提供有益的线索.方法用MTT实验观察不同时间收集的SIVmac239感染的CD4+T淋巴细胞(C8166)上清和未感染SIVmac239的CD4+T淋巴细胞的上清对恒河猴B淋巴细胞(MM133)增殖的抑制作用情况.结果SIVmac239感染的CD4+T淋巴细胞(C8166)上清含有抑制猕猴B淋巴细胞生长的因子,且其抑制作用效果随着作用时间的延长而增加.结论SIVmac239感染CD4+T淋巴细胞(C8166)可产生抑制B淋巴细胞(MM133)生长的因子.
-
表达猪源流感病毒HA基因重组伪狂犬病毒的构建
目的 获得共表达H1N1和H3N2亚型猪源流感病毒(SIV) HA 基因的重组伪狂犬病毒(PRV).方法 克隆H1N1以及H3N2亚型SIV的HA基因,将HA基因与PUC-TK转移载体进行酶切、连接来构建pUC-P-H1A-H3A重组表达质粒,用脂质体将其转染已感染PRV亲本病毒的Vero细胞,使其在Vero细胞内与PRV基因组发生同源重组.运用RT-PCR、间接免疫荧光等方法检测外源基因重组情况及其在Vero细胞内的表达,并通过Western-blot对表达产物进行免疫原性鉴定.结果 实验结果显示,外源基因HA已重组入PRV基因组,并在Vero细胞中有效表达,且所表达蛋白具有免疫原性.结论 HA基因重组PRV的构建成功为SIV HA基因重组PRV活载体疫苗的研究奠定了初步基础.
-
猪流感病毒和新型甲型流感H1N1病毒
2009年3-4月,墨西哥和美国部分地区相继报告了一些不寻常的人流感样病例[1-2].核酸序列分析显示了毒株来源于猪流感病毒(SIV),流行病学调查发现这些病例没有猪接触史,并且存在人与人感染.因此4月24日世界卫生组织(WHO)正式通报了这次疫情,并首次将其定义为全球流感大流行3级预警,随后在一周内又相继升级为4级和5级[3].
