三个HIV-1广谱中和表位与HBV S抗原融合表达可诱导小鼠特异性抗体应答

为了增强HIV-1交叉中和表位的免疫原性,本研究使用PCR克隆技术将HIV-1三个具有一定广谱中和活性的线性抗原表位ELDKWA(简称2F5)、NWFDIT(简称4E10)和GPGRAFY(简称447-52D)基因分别融合到HBV S基因的3味端,构建了分别表达这三种融合基因的天坛株重组痘苗病毒疫苗RVJ1175S-2F5、RVJ1175S-4E10和RVJ1175S-447-52D,使用这三种重组痘苗病毒感染的细胞培养上清液经分离纯化制备了三种相应的蛋白亚单位疫苗PS-2F5、PS-4E10和PS-447-52D,对重组痘苗病毒和亚单位疫苗中三种融合抗原的生物学及免疫学特性进行了比较研究.PCR和测序结果表明,三种融合基因序列正确重组到痘苗病毒TK区,HBsAg的ELISA检测表明三种融合蛋白有效表达并分泌到细胞培养上清液中,SDS-PAGE凝胶电泳显示三种纯化后的融合蛋白均含分子量为23kD和27kD两种典型HBsAg条带,Western blot证明这两个条带均能与HBsAg抗体反应,并分别能与三种表位相应的HIV-1单抗2F5、4E10和447-52D反应.小鼠免疫结果显示,三种重组痘苗病毒疫苗和三种蛋白亚单位疫苗均能诱发较高水平的HBsAg抗体和相应HIV-1交叉中和表位抗体,蛋白亚单位疫苗诱生的这两类抗体均明显高于对应的重组痘苗病毒疫苗.这些结果为进一步研究三种表位抗体的中和活性和通过不同类型疫苗联合免疫进一步增强其免疫效果研究奠定了基础.

表达人冠状病毒NL63棘突蛋白不同片段的重组痘苗病毒的制备与表达分析

HCoV-NL63是新近发现的人冠状病毒,对其外膜糖蛋白-棘突蛋白的表达及功能的研究仍有待深入.本研究利用天坛株痘苗病毒载体,克隆构建可表达HCoV-NL63棘突蛋白四个片段(N端棘突蛋白:S1;C端棘突蛋白:S2;受体结合区大片段:RL;受体结合区小片段:RS)的重组痘苗病毒(vJSC1175-S1;vJSC1175-S2;vJSC1175-RL;vJSC1175-RS),酶切测序证实表达载体构建正确,免疫荧光分析(IFA)各重组痘苗病毒中棘突蛋白不同片段的表达与定位,western-Blot分析表明各种重组蛋白表达正确.分析结果显示:4种重组蛋白均能有效表达,S1、RL及RS蛋白的荧光主要分布在细胞膜上,而S2蛋白的荧光则主要分布于细胞浆,各个片段的分子量大小与文献报道相同,并可进行正确的翻译修饰(糖基化).本研究首次采用痘苗病毒天坛株载体构建制备了表达HCoV-NL63棘突蛋白不同片段的重组痘苗病毒,为进一步分析人冠状病毒HCoVNL63棘突蛋白的结构功能及探索其抗原性和免疫原性奠定了基础.

表达SIV Gag/Env基因的DNA疫苗、重组腺病毒和重组痘苗病毒三载体疫苗联合免疫小鼠的细胞免疫研究

获得性免疫缺陷综合征即艾滋病是人类面临的严重公共卫生威胁,目前常用的药物疗法仍存在一定的缺陷,尚不能彻底治愈AIDS并阻断HIV的传播.将治疗型疫苗用于HIV感染的治疗具有一定的发展潜力,但缺乏适宜的HIV感染动物模型阻碍了治疗型HIV疫苗的研制.SIV能够感染非人灵长动物并引起类似AIDS的猴免疫缺陷病,因而常被用作研究HIV及其疫苗的替代动物模型.为了对SIV疫苗在猴感染模型中治疗SIV感染的效果进行评价,我们分别构建了表达SIV gag和env基因的DNA疫苗、重组腺病毒和重组痘苗病毒疫苗,并联合使用这三种疫苗免疫小鼠,对包括不同抗原组合、不同免疫次序及间隔的免疫策略进行探索和优化.IFN-γ酶联免疫斑点和小鼠体内杀伤试验的结果显示,通过三载体疫苗联合免疫,能够在小鼠体内诱导出强度较高、持续时间较长的SIV Gag/Env特异性细胞免疫反应.并且,重复免疫后仍可以诱导较高水平的免疫反应.该结果为在SIV感染猴模型中评价多载体疫苗序贯和重复免疫治疗SIV感染的研究奠定了基础,也为治疗型HIV疫苗的研究提供了参考.

DNA疫苗-重组痘苗病毒-蛋白疫苗联合诱导HIV-1抗体应答免疫程序的优化

比较DNA疫苗、重组痘苗病毒、蛋白疫苗不同免疫组合及免疫间隔时间对免疫效果的影响.采取Primeboost-boost免疫程序对豚鼠进行DNA疫苗初免三次,重组痘苗病毒rTV加强一次,分别间隔4、8、12周后免疫gp140蛋白加强免疫两次;同时,采取Prime-boost免疫程序重组痘苗病毒rTV初免一次,分别间隔4、8、12周后加强免疫gp140蛋白二次.末次免疫后不同时间点采血检测豚鼠血清中HIV-1特异性结合抗体、中和抗体以及抗体的相对亲合力.DNA-rTV-gp140免疫策略诱导的HIV-1 gp140/gp120抗体滴度、相对亲合力以及V1V2-gp70抗体OD值均高于rTV-gp140.对DNA-rTV-gp140免疫策略而言,间隔12周的免疫策略较间隔4周诱导了更高的V1V2-gp70抗体,而间隔4周更有利于提高抗体亲合力.rTV-gp140免疫策略间隔8或12周诱导的体液免疫更为理想.DNA疫苗初免,rTV和蛋白疫苗依次加强能够诱导更强的体液免疫,较长的免疫间隔有利于诱导V1V2-gp70抗体,较短的间隔有利于提高抗体亲合力.

重组痘苗病毒表达人免疫缺陷病毒中国株B'亚型Gag蛋白及免疫效果观察

为筛选用于我国HIV疫苗的候选基因,利用痘苗病毒载体构建表达HIV-1 B′亚型中国流行株RL42的Gag蛋白的重组病毒rVV-RL42gag,并免疫BALB/c小鼠,检测其诱导的特异性抗体及中和抗体,同时检测其诱导的特异性CTL及与中国流行株C(B′/C重组)亚型和国际流行株A亚型之间的CTL交叉反应.结果显示:重组病毒能很好地表达Gag蛋白,它具有与7株单克隆抗体结合的抗体表位;电镜下可观察到Gag蛋白形成的颗粒.rVV-RL42gag免疫小鼠后能诱导产生高滴度的特异性抗体和CTL,抗体具一定的中和活性,且检测到与C(B′/C重组)亚型和国际流行株A亚型之间的CTL交叉反应.这些结果表明,rVV-RL42gag具有良好的免疫原性,可进一步构建表达HIV B′亚型中国流行株RL42的Gag蛋白的重组痘苗病毒作为候选疫苗.

适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体的构建

为构建适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体,利用标记瞬时稳定的原理,在痘苗病毒单选择标记载体psc65的基础上,构建成带有neo和LacZ双选择标记的痘苗病毒载体pVI75.为检验载体pVI75的有效性,将HIV-1合成基因syngpnef插入到载体pVI75上,构建成转移质粒pVI75-syngpnef,并与天坛株752-1痘苗病毒共转染CEF细胞.筛选得到的重组病毒经PCR和Dot blot检验表明,标记基因已被删除,而目的基因被整合到痘苗病毒基因组上.Westem blot检测结果表明,目的基因的表达正确.痘苗病毒载体pVI75的构建使得疫苗株筛选的工作量大为降低,时间大大缩短,为利用痘苗病毒载体构建重组病毒疫苗株的研究提供了参考.

表达HIV多价抗原的重组痘苗病毒的构建及免疫效果研究

为了构建适用于中国的HIV候选疫苗,利用痘苗病毒天坛株表达中国HIV-1主要流行毒株CN54的gagpolΔ和gp140TM基因.实验结果显示,重组痘苗病毒能正确表达Gag和gp140TM蛋白.获得的重组痘苗病毒与DNA疫苗、重组腺病毒联合免疫Balb/c小鼠,并检测不同免疫程序在小鼠中诱导的细胞和体液免疫.免疫实验表明,DNA疫苗初始免疫,重组腺病毒与重组痘苗病毒依次加强所诱导的CTL应答、T淋巴细胞增殖以及中和抗体均高于其他免疫方案.DNA疫苗与两种活载体疫苗的联合运用,在小动物模型中取得了较好的免疫效果,这将为艾滋病疫苗的研究增加新的免疫策略.

甲3型流感病毒M2基因在痘苗病毒天坛株中的表达

为获得表达甲3型流感病毒(H3N2)M2蛋白的重组天坛株痘苗病毒RVJ1175M2,使用PCR方法扩增流感病毒全长M2基因,将其克隆到天坛株痘苗病毒同源重组质粒pJSC1175中,获得重组质粒pJSC1175M2,通过与痘苗病毒载体同源重组,构建了含流感病毒M2基因的重组痘苗病毒株RVJ1175M2.PCR检测结果证明,流感病毒(H3N2)M2蛋白基因准确插入到天坛株痘苗病毒TK区;Western blot、免疫荧光和流式细胞计数表明重组病毒RVJ1175M2可以有效地表达M2蛋白,表达的M2蛋白有两条带,分别为15kD和13kD,与相关文献报道一致;M2蛋白可有效分布在感染细胞的细胞膜上.这些结果表明重组痘苗病毒株RVJ1175M2可以有效地表达流感病毒M2蛋白,为使用表达M2蛋白的不同类型疫苗进行广谱流感疫苗效果的比较研究奠定了基础.

柯萨奇B3病毒基因在重组痘苗病毒中的表达

将编码柯萨奇B3病毒(CVB3)衣壳蛋白VP1和VP2的基因,分别克隆到具有7.5k启动子的痘苗病毒表达载体pGJP5上;将CVB3衣壳蛋白全基因克隆到具有T7启动子的痘苗表达载体pTM1上,并筛选到相应的重组痘苗病毒VVP1、VVP2和VVP/4/2/3/1.VVP1和VVP2稳定表达产物为CVB3衣壳蛋白VP1和VP2,而VVP/4/2/3/1的产物VP4/2/3/1为一无分泌性的多聚蛋白,且这三种表达产物均属无分泌性蛋白.为了表达成熟的CVB3衣壳蛋白,将去除5′端非编码区的CVB3全基因克隆到具有T7启动子的痘苗表达载体pTM1上,利用重组痘苗病毒VT7所提供的T7RNA聚合酶,在哺乳动物细胞中进行了暂时表达研究.Western blot分析提示,VP1、VP2和VP3蛋白得到成熟表达,且发现表达产物具有分泌性.本研究将为今后研究CVB免疫性打下基础.

PROSTVAC(R)——一种前列腺癌治疗性疫苗的研究进展

前列腺癌已经成为全世界男性常见的癌症之一,目前临床采用的手术、化疗等传统治疗手段存在前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen,PSA)复发、癌细胞转移等缺陷.PROSTVAC(R)疫苗的研发为前列腺癌的治疗提供了一种新的思路.PROSTVAC(R)是一种由导入了PSA和三合一共刺激分子(Triad of costimulatory molecules,TRICOM)基因的重组痘苗病毒和重组鸡痘病毒组成的疫苗.临床前研究和Ⅰ期临床研究分别证明了PROSTVAC(R)的免疫机理和安全性、耐受性;Ⅱ期临床研究证明了PROSTVAC(R)的有效性和耐受性,能够延长前列腺癌患者的总生存期(Overall survival,OS)达9个月左右;PROSTVAC(R)的Ⅲ期临床研究目前正在进行中,研究结果预计于2017年初发布.PROSTVAC(R)作为一种治疗前列腺癌的新型免疫疗法具有很好的前景.

欧洲型PRRSV、PCV2重组痘病毒疫苗灌注式生物反应器培养工艺的建立

目的 利用微载体-生物反应器技术培养乳仓鼠肾细胞,接种重组痘病毒rVTT-ORF2-EUO3O5,建立规模化制备欧洲型PRRSV、PCV2重组痘病毒疫苗的灌注式生产工艺. 方法 利用2L体积灌注式生物反应器培养BHK细胞,设定培养参数为温度37℃、溶氧度(DO)为60％,转速为80 r/min,pH值为7.3.当90％微载体表面贴满BHK细胞时以0.1 MOI的感染剂量接种重组痘病毒rVTT-ORF2-EUO3O5,设定感染参数为温度35℃、DO为50％、转速为50 r/min,pH值为7.1,继续培养观察. 结果 在采用灌注式生物反应器技术制备重组痘病毒过程中的细胞培养阶段,细胞培养96 h可获得1.587×1010个细胞数,细胞增殖39.67倍;在病毒增殖阶段,微载体上细胞完全脱落时的病毒滴度为2.12×109 PFU/ml. 结论 成功建立了欧洲型PRRSV、PCV2重组痘苗病毒灌注式生产工艺,为规模化制备重组痘病毒疫苗提供了技术参数.

重组结核抗原痘苗病毒免疫次数和免疫途径对免疫原性的影响

卡介苗(BCG)是目前用于预防结核病的惟一疫苗,但其对成年人结核病的预防效果不理想.本研究前期工作已构建了5种不同类型的表达结核杆菌特异抗原的重组痘苗病毒,其免疫小鼠2次后均可激发针对结核杆菌抗原的特异性细胞免疫.然而,重组安卡拉痘苗病毒(MVA)是一活的病毒载体[1],此重组病毒是否能多次免疫动物以及多次免疫动物后能否产生更有效的免疫反应尚不清楚.

中国呼吸道合胞病毒地方株G蛋白在重组痘苗病毒中的表达

目的构建表达中国呼吸道合胞病毒(RSV)地方株G蛋白基因的重组痘苗病毒,以用于RSV感染防治的研究.方法用基因克隆技术将中国RSV地方株G蛋白基因插入到痘苗病毒载体中,与痘苗病毒共感染获得重组病毒.用免疫印迹、ELISA、蚀斑减少试验等方法检测表达产物的免疫原性及生物活性.结果 RSV地方株G蛋白在痘苗病毒中获得较好的表达,表达产物的糖基化程度较高,且该重组病毒免疫家兔可诱发特异性抗体产生.蚀斑减少试验证明,用该表达产物制备的抗血清具有中和病毒的活性.结论重组病毒表达的中国RSV地方株G蛋白具有较好的抗原性、免疫原性等生物活性.

实时定量PCR方法监测重组痘苗外源基因传代稳定性

目的 建立实时定量PCR方法 以监测外源基因在不同重组痘苗代次中的稳定性.方法 裂解法提取8个代次插入有HIV基因的重组痘苗DNA,用实时定量PCR的绝对和相对定量方法 ,研究不同代次基因组中插入的外源基因与痘苗基因组的数量关系.结果 绝对和相对定量方法 均证明,在传代过程中,重组痘苗中的外源基因有缺失现象.结论 建立的实时定量PCR方法 可以特异、定量地分析外源基因在重组痘苗中的稳定性.

重组痘苗病毒HIV疫苗肌注初免蛋白疫苗滴鼻加强后激发高强度黏膜IgA应答反应

目的：研究痘苗病毒载体HIV疫苗和蛋白疫苗联合运用所激发的黏膜免疫应答，探讨不同途径免疫产生黏膜免疫应答的异同，进一步证实MF59佐剂在激发疫苗黏膜免疫应答方面的效果。方法以表达HIV-1中国流行株 CN54 Gag-Pol-Env 基因的重组痘苗病毒天坛株rTV，重组HIV-1膜蛋白gp140三聚体为抗原，辅以水包油型佐剂（ oil-in-water） MF59，在小鼠模型上，通过不同免疫途径组合联合免疫BALB／c小鼠，即重组痘苗病毒初免，免疫途径为滴鼻或肌注，gp140与MF59混合物加强免疫，免疫途径为滴鼻、肌注或皮下，探讨能诱导高效黏膜免疫应答的免疫策略。通过ELISA方法对小鼠血清中HIV-1特异性的IgG和IgA及唾液和阴道分泌物中IgA进行检测。结果MF59是一种良好的黏膜佐剂，能显著增强HIV蛋白疫苗的黏膜免疫应答，所激发的黏膜IgA滴度与鞭毛素蛋白（ SF）和霍乱毒素B亚单位（ CTB）的黏膜佐剂活性相当；重组痘苗病毒初免（肌注），gp140与MF59加强（滴鼻）联合免疫策略能诱导高水平的血清IgA和黏膜IgA抗体（P＜0．05），其抗体滴度分别高达1∶15000和1∶600。结论重组痘苗病毒天坛株rTV系统途径免疫小鼠后蛋白疫苗黏膜途径加强能激发高强度黏膜免疫应答，这一免疫策略及组合可为阻断通过口腔和阴道黏膜传播的艾滋病疫苗研究提供参考。

CEA重组痘苗病毒(rV-CEA)接种小鼠抗肿瘤作用探讨

癌胚抗原（CEA）阳性恶性肿瘤的发病率很高，对这些肿瘤多数都缺乏有效的治疗措施。国外有学者设想借助痘病毒的强免疫原性及协同抗原提呈作用，去克服CEA的弱免疫原性，因而构建了CEA-重组痘苗病毒(rV-CEA)，并将其接种治疗荷瘤动物，治疗效果是肯定的。我室亦进行了类似的研究，证实了rV-CEA对疗效的确切性及安全性。本研究从过继免疫治疗的角度探讨rV-CEA抗瘤作用。

表达 HIV-1建立感染相关病毒（T／F）膜蛋白的重组痘病毒与蛋白疫苗联合免疫豚鼠后体液免疫特征研究

目的：研究表达HIV-1建立感染相关病毒（ T／F）膜蛋白的重组痘苗病毒rTT-B、rTT-C和rTT-CON与gp140蛋白疫苗联合免疫豚鼠后抗体反应情况。方法采取Prime-boost免疫策略对豚鼠进行rTT初免1次，间隔4、8周后gp140蛋白疫苗加强免疫2次。免疫前和末次免疫后2、6、10周采豚鼠血，检测血清中HIV-1特异性结合抗体、中和抗体以及抗体的相对亲和力。结果（1） rTT-B、rTT-C和rTT-CON三种病毒和蛋白联合免疫均诱导了强烈的针对HIV-1 B′／C、B、AE亚型特异性结合抗体，抗体滴度范围为111430～1024000，其中，rTT-C和rTT-CON和蛋白联合免疫2周后诱导的B′／C和AE亚型特异性抗体滴度显著高于rTT-B（P＜0．05），但3种病毒蛋白联合免疫诱导的B亚型膜蛋白特异性抗体滴度差异无统计学意义。（2）3种病毒蛋白联合免疫都能诱导较强滴度针对SF162和ZM109的中和抗体，抗体滴度范围为83．76～649．30，3种病毒间差异无统计学意义。（3）3种病毒蛋白联合免疫都能诱导与免疫保护有关的HIV-1 V1V2-gp70特异性抗体，3种病毒间差异无统计学意义。（4）3种病毒蛋白联合免疫诱导的抗体对HIV-1 B′／C、B、AE亚型膜蛋白具有较强亲和力，3种病毒间差异无统计学意义。结论重组痘苗病毒rTT-B、rTT-C和rTT-CON与gp140联合免疫豚鼠后可以有效诱导出针对同源和异源病毒膜蛋白的结合及中和抗体。

重组痘苗病毒介导的IL-2抗小鼠FBL-3细胞肿瘤的实验研究

重组痘苗病毒嵌合巨蛋白的免疫学研究

目的 pSFJ16与pSFJ38均是以牛痘病毒包涵体(ATI)启动子和分别串联的16个和38个p7.5突变型早期启动子为基本构件组成的复合型启动子(ATI-p7.5)、痘苗病毒复制非必需区血凝素(HA)基因为侧翼的痘苗病毒表达载体.分别插入编码艾滋病病毒(HIV-1)外膜蛋白env、核心蛋白gag与编码干扰素(IFNá-2b)基因,观察其表达产物诱导的机体内产生抗体效价的变化规律.方法利用分子克隆技术构建重组质粒,经脂质体转染与野生型痘苗病毒在Cos-7细胞内同源重组,筛选、纯化、获得重组痘苗病毒vJ16env/IFNá-2b和vJ38gag/IFNá-2b.免疫小鼠后,经间接ELISA分折免疫小鼠血清抗体的OD490值变化.结果免疫小鼠后体内抗体的OD490值,实验组与阴性对照组平均数有显著性差异(P＜0.05),实验组与阳性对照组之间无显著性差异(P＞0.05).结论重组痘苗病毒vJ16env/IFNá-2b和vJ38gag/IFNá-2b免疫小鼠后可诱导机体产生高滴度的抗HIV-1env、gag与IFNá-2b巨蛋白抗原的抗体,蛋白稀释度与血清抗体OD490值呈负相关.

重组痘苗病毒免疫小鼠的实验研究

目的观察艾滋病病毒外膜蛋白、核心蛋白与干扰素(HIV-lenv/IFNα-2b、HIV-1gag/IFNα-2b)融合基因的表达产物,能否作为理想的基因疫苗,使机体产生体液免疫和细胞免疫应答.方法以小鼠为实验对象,用重组病毒vJ16env/IFNα-2b、vJ38gag/IFNα-2b免疫小鼠,以生理盐水和野生型痘苗病毒为对照组,检测小鼠外周血与脾淋巴细胞对ConA、Lps的反应性.用间接ELISA试验检测了重组病毒诱导小鼠产生的HIV-lenv/IFNα-2b、HIV-lgag/IFNα-2b抗体,用流式细胞仪测定小鼠脾细胞CD+4、CD+8T细胞计数.结果外周血与脾淋巴细胞对ConA、Lps的反应性,实验组与对照组比较差异有显著性意义(P＜0.05).vJ16env/IFNα-2b与vJ38gag/IFNα-2b能激发小鼠体内产生高滴度的抗体.CD+4、T淋巴细胞与对照组比较差异有显著性意义(P＜0.05).CD+8T淋巴细胞与对照组比较无差异性,但呈增高趋势.结论重组痘苗病毒能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫.重组痘苗病毒能在体外与HIV-1env和HIV-1gag阳性血清发生特异性反应,具有免疫原性和免疫反应性.