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蜱类携带粒细胞无形体的核酸检测及核酸序列分析
目的 了解蜱类自然感染粒细胞无形体(anaplasma phagocytophilum)的状况,为人粒细胞无形体病的预防、控制提供技术支持.方法利用分子生物学技术,通过对野外采集的蜱类样品的核酸(DNA)提取、聚合酶链反应(套式PCR)、凝胶电泳分析以及核酸序列分析等,对蜱类携带的粒细胞无形体进行确认.结果在大连地区采集的长角血蜱(Haemaphysalis longicornis中检测到粒细胞无形体.序列分析结果表明,与GenBank数据库中已注册的粒细胞无形体核酸序列有高度的相似性(97％～99％).结论我国大连地区存在蜱粒细胞无形体感染.应加强对该地区蜱类的监测和控制,防止因蜱类叮咬导致人粒细胞无形体病的暴发流行.
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满洲里口岸蜱类携带斑点热群立克次体的核酸检测及核酸序列分析
目的 了解中俄边境地区蜱类自然感染斑点热群立克次体(Rickettsia japonica)的状况,为蜱传斑点热的监测和检测提供技术支持.方法 采集鼠类寄生蜱,研磨后提取蜱DNA,利用PCR扩增斑点热群立克次体Omp A基因,对阳性产物进行序列分析.结果 在满洲里地区,鼠类体表采集到的蜱类样本,均为全沟硬蜱(Ixodes persulcatus),从8只蜱中检测到斑点热群立克次核酸.序列分析结果表明,其中12号标本中检出的斑点热立克次体与GenBank数据库中已注册的斑点热群立克次核酸序列有高度的相似性(98％～99％).结论 应加强对内蒙古满洲里地区蜱传斑点热的监测和检测,防止蜱传疾病的发生.
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山东地区汉族人 HLA-DPB1基因单核苷酸多态性
使用第十一届国际组织相容性会议提供的HLA-DPB1引物序列,由PCR技术扩增人HLA-DPB1基因第二外显子.产物纯化后,直接核酸序列分折确定个体的HLA-DPB1外显子核酸序列.使用基因定型软件与由国际上公布的HLA-DPB1核酸序列构建的基因型核酸序列数据库进行比较,确定个体的基因型别、确定等位基因类型.研究结果提示中国人HLA-DPB1第二外显子基因序列与国际上公布的序列基本一致,但有不同之处, 多处存在单核苷酸多态性(SNP),提示存在有新的等位基因.对51例个体研究显示,出现频率高的等位基因是DPB1*02012.
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风疹病毒JR23株E1包膜糖蛋白的基因克隆与序列分析
目的建立风疹病毒包膜糖蛋白E1的克隆载体;研究E1基因变异情况,并对其序列进行系统发生树分析.方法利用RT-PCR方法扩增并回收风疹病毒JR23株的包膜糖蛋白E1的基因片段,将其与PMD-18T载体连接,经氨苄青霉素筛选,酶切鉴定,以获得风疹病毒E1蛋白基因的克隆.将此基因测序后,利用DNASTAR和WINSTAR软件包绘制系统发生树进行序列之间的比较分析.结果筛选出含有风疹病毒E1蛋白基因的克隆.序列分析及发生树的绘制表明:JR23株与日本TCRB株及英国THOMAS株差别小,分别为0.9%和1.2%.与北京BRD2株及香港XG379株差别大,分别为7.6%和7.3%,与其它各株的差别均小于3%(除NC株为3.7%外),系统发生也与THO-MAS株、TCRB株近,与BRD2株远.结论克隆载体的建立为进一步研究E1基因与糖蛋白功能的关系提供基础.系统发生树表明中国不同地区风疹流行株基因序列存在明显差异.这对风疹病毒遗传与变异、分子流行病学研究,以及制备有效的亚单位疫苗提供了资料.
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无症状携带献血者HTLV-Ⅰ病毒的前病毒长末端核酸序列分析
目的 了解本地区检出的无症状献血人群携带人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)株亚型.方法 对3份HTLV-Ⅰ/Ⅱ血清阳性标本,采用Nested-PCR方法检测前病毒长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)并测序分析.结果 从1名有多次合格献血经历,但抗体筛查强阳性(OD =3.000)血样中提取到HTLV-Ⅰ前病毒DNA.核苷酸序列分析提示,与日本原型ATK株比较其序列一致性为98.4％ (738/750).结论 试验认定该HTLV病毒为世界群b型日本型毒株,并提示无症状携带HTLV-Ⅰ病毒的献血者具有潜在经血传播的风险.
关键词： HTLV Nested-PCR 核酸序列分析 无症状献血者 -
鼠类携带汉坦病毒的核酸检测及核酸序列分析
目的 研究国境口岸地区鼠类自然携带汉坦病毒( Hantavirus,HV)状况,为国境口岸地区鼠类防治及肾综合征出血热疫情控制提供基础数据.方法 利用分子生物学技术,通过对采集于口岸地区的鼠类样品的核酸(RNA)提取、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、凝胶电泳分析以及核酸序列分析等过程,对口岸地区鼠类携带汉坦病毒的状况进行确认.结果 在辽宁口岸捕获的14只褐家鼠( Rattus norvegicus)中,其中7只检测到汉城型汉坦病毒.序列分析结果表明,与GenBank数据库中已注册的汉坦病毒核酸序列具有高度的相似性(97％ -99％).结论 辽宁口岸褐家鼠中汉城型汉坦病毒的感染率较高.应加强对口岸地区鼠类的监测和控制,防治肾综合征出血热疫情在口岸地区的暴发流行.
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突变型p16基因exon2 DNA探针的制备及应用
在多种肿瘤细胞系中p16基因出现高频率的缺失和突变[1～4].为了研究人肿瘤中p16基因的变化,我们采用DNA重组技术,从一株人黑色素瘤细胞系中获取了突变型p16基因第二外显子(exon 2)DNA片段并制备成基因探针[5],应用该探针对40例卵巢肿瘤的p16基因进行了核酸杂交检测.
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石家庄市学龄儿童龋病细菌类型的核酸序列分析
目的 探讨儿童龋病发生与致龋菌基因突变的关系.方法 采集60名石家庄市8～12岁学龄儿童的口腔牙菌斑样本,设计特异性变异链球菌的引物,进行PCR扩增和核酸序列分析,同时进行龋病的问卷调查.结果 学龄儿童在睡前饮料和甜点及刷牙习惯上,差别无显著性.龋病组与无龋组牙菌斑中变异链球菌检出率分别为70％和33.3％,差别有显著性(P＜0.05).无龋组变异链球菌突变率(32.3％～39.2％,平均36.1％)高于龋病组变异链球菌突变率(12.7％～31.3％,平均21.3％),差别有显著性(P＜0.05).结论 变异链球菌突变率达到或超过36.1％水平时,致龋能力明显降低(P＜0.05).
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DNA标记技术在螨类系统学研究中的应用
长期以来,螨类主要依靠其形态特征进行系统学研究.DNA标记是指能反映生物个体或物种间基因组中某种差异特征的DNA片段.近年来,DNA标记技术在螨类系统学研究中得到越来越广泛的应用.本文综述了随机扩增多态性RAPD、限制性内切酶片段长度多态性RFLP、微卫星SSR、核酸序列扩增、扩增片段长度多态性AFLP和直接扩增片段长度多态性DALP等6种DNA标记技术在螨类系统学研究中的应用现状及前景.
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载脂蛋白E基因三种分型检测方法临床效能对比评价
目的 对3种载脂蛋白E(apo E)基因型分析的方法:多重特异性扩增突变系统快速分型法(Multi-ARMS PCR)、聚合酶链反应-限制性核酸内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)、聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)进行评价,试图对apo E基因分型的方法进行对比评价.方法 对518名健康调查者分别采用Multi-ARMS PCR、PCR-RFLP、PCR-SSCP等方法进行apo E基因型的分析,并后对所有标本采用核酸测序的方法进行分型确证.结果 在核酸序列分析结果一致性比较上,3种apo E基因分型的方法有所不同(Multi-ARMS PCR Kappa值为0.964、PCR-RFLP为0.991、PCR-SSCP为0.913;Kappa越接近1,提示一致性越好).结论 PCR-RFLP在3种apo E基因型分析方法中可靠.
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核酸序列测定技术分析HBV耐药基因与亚型鉴定
目的:用荧光标记核酸序列测定技术分析患者携带的HBV基因型,判断所携带的HBV亚型以及治疗过程中是否产生耐药性.方法:采用PCR产物直接进行核酸序列分析,使用计算机模拟核酸杂交技术分析HBV基因的亚型与耐药基因.结果:扩增产物的核酸序列分析表明,设计的引物序列在确定的条件下可以特异性的扩增HBV相应的基因片段.患者耐药基因分析结果分别为HBV YVDD变异和YIDD变异;病毒亚型分析结果提示患者携带的HBV均为adr亚型.结论:本方法能够准确判定HBV的YVDD与YIDD变异及其它类型突变,并确定患者携带HBV的基因型,能够准确、客观地反映出病原体的耐药性,可以作为合理用药的重要参考依据.
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华中和华东地区肝豆状核变性患者ATP7B基因第13号外显子突变的研究
目的 对华中和华东地区肝豆状核变性(HLD)患者ATP7B基因第13号外显子突变进行研究.方法 应用PCR-DNA测序技术对来自我国华中和华东地区的139例非同源家系的HLD患者的ATP7B基因第13号外显子进行检测,并与52名正常对照者进行比较.结果 正常对照组测序未见异常.HLD组共检出6种ATP7B基因的突变类型和1种多态,其中Gly988Val杂合突变为新的发现.HLD组突变及多态总的检出率为29.49%(41/139),染色体突变频率为15.83%(44/278);其中Pro992Leu纯合或杂合突变的检出率为23.02%(32/139),其染色体突变频率为12.59%(35/278).结论 ATP7B基因第13号外显子是华中和华东地区HLD患者的一个基因突变热区,是筛选HID可疑患者时优先检测的外显子之一.
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福建分离株(FJ96-71)肠道病毒新血清型的鉴定及特征分析
目的对肠道病毒福建分离株FJ96-71进行新血清型鉴定及其特征分析.方法应用传统的血清中和试验及分子生物学方法进行血清型的鉴定,并通过序列比对分析其遗传特征.结果 FJ96-71无法被常规用于型别鉴定的血清所中和,且其特异性型中和抗体也无法中和本实验室保存的其它22个血清型分离株病毒,提示FJ96-71可能为一新血清型.全基因组序列分析显示其VP1基因序列与美国分离株USA/OK85-10362(AY556070) 核苷酸同源性80.6%(氨基酸同源性95.5%),而与其它血清型的参考株序列同源性均低于69.7%,说明FJ96-71与USA/OK85-10362为同一血清型,即新近拟定的肠道病毒75型(EV75).针对P1区序列分析结果进一步确证此结果.FJ96-71与USA/OK85-10362在5'非编码区以及P2、P3非结构编码区的差异性说明EV75早已在外界循环且波及范围较广.结论 FJ96-71与USA/OK85-10362一样同属于肠道病毒一新血清型-EV75.
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猪流感病毒和新型甲型流感H1N1病毒
2009年3-4月,墨西哥和美国部分地区相继报告了一些不寻常的人流感样病例[1-2].核酸序列分析显示了毒株来源于猪流感病毒(SIV),流行病学调查发现这些病例没有猪接触史,并且存在人与人感染.因此4月24日世界卫生组织(WHO)正式通报了这次疫情,并首次将其定义为全球流感大流行3级预警,随后在一周内又相继升级为4级和5级[3].
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诺沃克样病毒广州地区分子流行病学分析
目的 根据广州市多起由诺沃克样病毒引起的食物中毒患者粪便标本中检测到的Ⅱ型诺沃克样病毒序列,初步了解广州地区诺沃克样病毒的分子流行病学情况.方法 用RT-PCR对病人粪便中的诺沃克样病毒核酸进行扩增,将阳性产物测序,并与GenBank中的序列相比较.结果 归纳出4个代表性序列,并且相似率都不高.结论 我国存在诺沃克样病毒引起的食物中毒,而其RNA复制酶的保守区段变异普遍较大.
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汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白M的基因克隆与序列分析
目的:建立汉坦病毒(HV)包膜糖蛋白M的克隆载体;研究M基因的变异情况,并对其序列进行系统发生树分析.方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增GM04-38 M片段的基因,产物纯化后克隆于PMD-18T载体,经氨苄青霉素筛选,酶切鉴定,并进行序列测定,应用DNASTAR软件将它与世界范围内分离的病毒株同一基因序列分析比较.结果:筛选出含有HV M蛋白基因的克隆.GM04-38株M片段的全基因序列共3 651个核苷酸,4种核苷酸的比例分别为:A 30.46%,T 30.13%,G 20.84%,C 18.57%.序列同源分析表明,GM04-38株与Z37株核苷酸同源性高(97.3%),属于SEO型HV.与其他SEO各株的差别均小于18.0%;绘出了核苷酸系统发生树.结论:成功地建立汉坦病毒M蛋白基因克隆载体;中国不同地区汉坦病毒流行株基因序列存在明显差异.这为研究HV遗传与变异以及制备有效的亚单位疫苗奠定了基础.
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核酸序列分析在真菌分类鉴定中的应用
传统的真菌分类鉴定以其形态学特征、生长特性以及生理生化指标为基础,然而真菌的形态特征复杂,且其生长特性和生理生化指标随着环境的变化而不稳定.
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血清学表型为Ay个体的基因分析
目的 研究Ay亚型个体红细胞上血型抗原弱表达的原因,旨在揭示其分子学特征.方法 对血清学表型为Ay的个体,通过PCR-SSP进行基因分型,并且测序分析7个外显子和部分内含子,与A101等位基因参比序列对比.结果 血清学表现为Ay的个体,PCR-SSP基因分型定为A102/A102,序列分析发现存在A102特异性突变467C>T,同时还发现1009A/G杂合,Interon5的517位二条链均有缺失,一条缺G,一条缺C(517G-/C-).结论 Ay 型的分子遗传学背景复杂,467C>T突变、1009A/G杂合、Interon5的517G-/C-缺失尚不足以解释其红细胞上抗原的弱表达.
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Wilson's病8号外显子突变研究
目的 对中国人WD基因8号外显子进行突变分析.方法 对中国人Wilson's病(Wilson's disease,WD)45例患者以及20例正常人的ATP7B基因8号外显子进行SSCP分析,对有异常者进行测序,根据突变点序列设计合适的内切酶对所有患者进行酶切分析.结果 正常组未见异常.患者组发现exon 8有泳动异常,序列分析证实G2273T置换,即Arg778Leu突变.用限制性内切酶Msp Ⅰ对45例患者以及20例正常对照进行该位点酶切分析,表明正常组未见异常,患者组有2例突变纯合子,占患者总数4.4%,11例杂合子,占12.2%.外显子8的Arg778Leu突变率占WD突变基因的16.67%.检测了2个突变家系.结论 8号外显子突变可能是中国人WD发病的较重要原因.
