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基于ITS2序列的藁本与常见混伪品的分子鉴定
本文对药材藁本及其常见混伪品的rDNA ITS2进行了PCR扩增、测序,并运用MEGA软件对该区进行序列分析,比较了ITS2碱基序列的差异及其规律,同时为药材藁本及混伪品的指纹图谱鉴别提供分子标记.结果显示辽藁本的种内差异较小,而与其主要混伪品间存在较大的变异,差异性范围为5.7%～35.3%.根据ITS2序列特征构建的系统树,药材藁本的样品紧密的聚在一起,和其混伪品可以明确区分,支持率为100%.此外,ITS2的二级结构可作为鉴定药材藁本及混伪品种的一个方法,具有一定的系统学及分类学意义.本研究表明rDNA ITS2序列分析可作为药材藁本与混伪品的一种有效的分子鉴定方法,具有重要的应用价值.
关键词： 藁本 混伪品 核糖体DNA 第二内转录间隔区(rDNA ITS2) -
我国八代按蚊及其近缘种rDNA-ITS2序列差异和分类地位的探讨
对采用自四川、辽宁、山东及韩国的八代按蚊和四川的筠连按蚊,进行核糖体DNA第2内转录间隔区(rDNA-ITS2)序列差异分析.结果显示:四川、辽宁及对照韩国八代按蚊群体间的ITS2序列同源性达96.7%～99.6%;筠连按蚊与各地(除山东外)八代按蚊间序列同源性达96.2%～99.8%,与四川同域的八代按蚊除一个碱基缺失外,rDNA-ITS2序列完全相同,显然属于种内变异水平,筠连按蚊可能是八代按蚊的同物异名:而山东八代按蚊与各地八代按蚊相比则同源性仅70.4%～71.1%,差异明显增大,提示山东的"八代按蚊"为一存疑蚊种,其分类地位尚需要进一步研究确定.
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西方角蝇和截脉角蝇rDNA的ITS基因序列对比研究
为了解决传统方法研究蝇类传播媒介费时费力及难以准确鉴定其幼虫等问题,本研究以采自内蒙古北部戈壁地区骆驼及其粪便上的西方角蝇和截脉角蝇为研究对象,将2种角蝇rDNA的ITS序列片段进行了测序分析.运用DNAStar 5.0软件中的MegAlign工具和Clustal W程序,对2种角蝇的ITS序列进行了分析.结果表明,西方角蝇扩增的ITS片段大小为1 047 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITSI(464 bp)、5S(122 bp)、ITS2a(29 bp)、2S(30 bp)和ITS2(349 bp)序列;截脉角蝇扩增的ITS片段大小为1 015 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITSI(457 bp)、5S(122 bp)、ITS2a(29 bp)、2S(30 bp)和ITS2(324 bp)序列.2种角蝇的ITS序列(去掉18S及28S部分后)差异显著,有190个识别位点,差异性达到14.9%.上述结果为进一步研究西方角蝇和截脉角蝇的分子生物学特性奠定了重要基础.
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中国耶氏肺孢子虫基因型的初步分析
为研究我国耶氏肺孢子虫的基因分型,利用巢式PCR方法扩增24例肺孢子虫肺炎(PCP)患者支气管肺泡灌洗液中的耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jiroveci)核糖体DNA内转录间隔区(ITS1-5.8S rDNA-ITS2)基因.纯化回收目的片段,将其克隆到PMD18-T载体,并导入JM109细胞系中,每个标本制备3～5个克隆,提取质粒测序.从19例患者的标本中检出ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因,其中12份标本的25个克隆的测序结果可用于基因分型.经与Lee等(1998)的分型标准进行比对,本组病例耶氏肺孢子虫的ITS1分为B、E、I、N 4型,常见的为E型;ITS2分为a、b、e、h、i、n 6型,常见的为i型;ITS基因分9型,以Bi多见,有2份标本存在混合感染.
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人工转录激活子样效应因子核酸酶与多位点基因打靶载体的构建与鉴定
目的 构建并验证针对人类基因组核糖体DNA(rDNA)序列的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)表达载体与人类通用多位点基因打靶载体.方法 运用在线软件TALENs Targeter在rDNA序列上设计TALEN切割位点,并构建针对该位点的TALEN表达载体,利用细胞转染技术,筛选出一对有较高活性的TALEN,并计算其切割效率.将TALEN切割位点两侧的同源重组引导序列DS1、DS2以及GFP表达元件克隆到pUC-19质粒中,终将TALEN与多位点基因打靶载体共转染293T细胞,经PCR与测序鉴定,对目的基因整合情况进行验证.结果 经酶切、测序鉴定,成功获得一对切割活性高达78.5％的TALEN(TALEN-L1R2),成功构建人类细胞通用的多位点基因打靶载体pUC-DS1-EGFP-DS2;两种技术结合后将目的基因GFP成功整合于293T细胞基因组中.结论 TALEN与多位点打靶技术结合,可有效将目的基因整合于基因组中.
关键词： 转录激活子样效应因子核酸酶 基因打靶 核糖体DNA -
用ITS和TUB序列差异鉴定临床相关波氏假阿利什霉/尖端赛多孢
目的 探讨用rDNA基因ITS及TUB的差异对15株致病性波氏假阿利什霉/尖端赛多孢重新分类鉴定,以了解致病菌株种类及指导临床治疗的意义.方法 对15株北京大学真菌与真菌病研究中心保存的临床相关波氏假阿利什霉/尖端赛多孢采用形态学方法观察菌落形态及显微镜下特征,糖同化试验方法观察菌株对D-核糖的利用,以及对菌株ITS及TUB进行Clustal X序列比对和MEGA 4方法种系发生研究.结果 15株波氏假阿利什霉/尖端赛多孢菌落形态学和显微镜特征无明显差异,仅1株出现有性期表现.糖同化试验显示所有菌株均可利用D-核糖.15株菌经与荷兰CBS网站(http://www.cbs.knaw.nl)数据库中模式株比对以及绘制种系发生图,显示分属于波氏假阿利什霉复合种第4支Scedosporium apiospermum和第5支Pseudallescheria boydii,且分别为4和11株.结论 对于波氏假阿利什霉复合种仅依赖形态学和生理生化特征难以准确鉴定,且耗时长,而通过多位点基因片段序列分析能可靠鉴定波氏假阿利什霉/尖端赛多孢.对临床相关的波氏假阿利什霉/尖端赛多孢建议在形态学基础上结合分子方法进行种水平鉴定.
关键词： 波氏假阿利什霉/尖端赛多孢 核糖体DNA 微管蛋白 -
中药葛根及其近缘种的rDNA-ITS序列分析
目的探讨中药葛根及其近缘种的分类地位及系统发育关系,同时为葛根的指纹图谱鉴别提供分子标记.方法测定并分析葛属3种植物的内转录间隔区(ITS)序列及5.8S rRNA基因序列.结果测得该属3种植物的片段包括ITS1,5.8S和ITS2全长序列以及18S,26S部分序列.野葛与粉葛的ITS1,ITS2的差异性分别在2.10%和2.09%以内,而山葛与野葛、粉葛在ITS1,ITS2的差异性则分别达到8.14%和12.82%以上.根据ITS序列特征构建的系统树,不同产地的野葛首先聚类,然后与粉葛聚在一起,山葛后聚类.结论根据分子性状特征,粉葛作为野葛的变种,山葛独立成种较为合理.ITS序列特征是中药葛根鉴别的有效分子标记.
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DNA序列分析在吸虫种株基因差异研究方面的应用
近年来,分子生物学技术在现代寄生虫学种、株基因差异的研究中得到了广泛的应用,本文综述了核糖体、线粒体DNA序列分析技术在吸虫种、株基因差异研究的进展.
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海南岛按蚊的鉴定和迷走按蚊的进化研究
目的 阐明海南岛某些按蚊的分类地位,探讨迷走按蚊与其近缘种的亲缘关系. 方法 对采自海南岛8个地点的按蚊依据形态和分子特征进行鉴别研究,应用的分子特征包括核糖体DNA(ribosomal DNA,rDNA)第2内转录间隔区(second internal transcribed spacer,ITS2)和28S第3编码区(third domain,D3)序列,综合分析迷走按蚊及其近缘种的ITS2和D3序列,构建系统发育树. 结果 本研究共鉴定按蚊407只,其中84.9％的成蚊分子鉴定与依据形态鉴定的结果一致.在228条迷走按蚊的ITS2序列中,部分个体在2个位点存在单碱基套峰(G/A),出现的频率分别为57.9％、64.8％,同时有两个套峰的占样本数的57.0％,其他位点保守.迷走按蚊的D3序列,在种内无碱基差异.结合本研究和文献的迷走按蚊及其近缘种ITS2序列构建的ML树,显示迷走按蚊与浅色按蚊MC/D亲缘关系近,与另一支的浅色按蚊B、圣代克按蚊复合体的亲缘关系较远.关于未订名种NBC (Anophelessp.NBG)的分类地位,依据分子特征鉴定其为浅色按蚊B,可能是圣代克按蚊复合体新的成员种.结论 鉴定形态在个体间变异大的种类时,客观的分子特征更具重要性,迷走按蚊与浅色按蚊MC/D具较近的亲缘关系.
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华支睾吸虫病患者粪便虫卵核糖体DNA内转录间隔区序列分析
目的 通过PCR方法扩增华支睾吸虫病患者粪便虫卵核糖体DNA (ribosomal DNA,rDNA)内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列进行分析,探讨其用于华支睾吸虫感染检测的价值. 方法 提取2例华支睾吸虫患者粪便中的虫卵DNA作模板,以rDNA ITS基因片段为目的片段进行PCR扩增,对扩增片段进行测序分析. 结果 从2例患者粪便虫卵样本中均扩增出1 123 bp的条带,经序列比对确定患者粪便中的虫卵为华支睾吸虫卵.测序分析发现本研究的两个样本与中国黑龙江分离株(KF740425)相似性为100％. 结论 本研究从2例华支睾吸虫病患者粪便虫卵中成功扩增出rDNA ITS基因,为从分子生物学角度检测华支睾吸虫病提供了资料.
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赫坎按蚊种群近缘种核糖体基因内转录第二间隔区序列分析
目的分析赫坎按蚊种群内4个近缘种核糖体基因内转录第二间隔区(rDNA ITS2)特征.方法采用特异性ITS2引物对中华按蚊和嗜人按蚊江苏实验株、辽宁省沈阳市和朝鲜开城现场捕获的嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNA ITS2进行PCR扩增、基因测序和限制性内切酶酶切位点图谱分析.结果与结论赫坎按蚊种群近缘种中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNA ITS2分别为472、452、456和456 bp,各基因序列存在明显差异并存在不同的限制性内切酶酶切位点.
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PCR-RFLP技术用于鉴别赫坎按蚊复合体近缘种按蚊的研究
目的区别赫坎按蚊种团内近缘种.方法应用聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)技术,对辽宁省现场捕获的按蚊用特异性ITS2引物进行PCR扩增,限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ消化,琼脂糖凝胶电泳分析.结果中华按蚊的PCR扩增产物能被限制性内切酶RsaⅠ酶切成350 bp和200 bp两条酶切DNA条带;嗜人按蚊核糖体DNA(rDNA)的PCR扩增产物能被限制性内切酶HinfⅠ酶切成410 bp的酶切DNA条带; 雷氏按蚊的ITS2基因PCR扩增产物能分别被限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ酶切,分别显示350 bp和400 bp的酶切DNA条带;八代按蚊的PCR扩增产物没有显示明显的限制性内切酶RsaⅠ或HinfⅠ酶切条带.结论依据rDNA的ITS2区段基因特征建立的PCR-RFLP技术可用于鉴别赫坎按蚊种团的中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4个近缘种按蚊.
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嗜人按蚊和中华按蚊的ITS2区段序列分析和比较
目的分析和比较不同地区中华按蚊和嗜人按蚊的ITS2区段的基因特征.方法采用特异性ITS2引物对嗜人按蚊和中华按蚊江苏实验株以及从湖北省和越南现场捕获的嗜人按蚊和中华按蚊进行PCR扩增、克隆并对ITS2区段序列进行分析.结果嗜人按蚊实验株的ITS2区段序列有452 bp,与嗜人按蚊现场株的ITS2区段序列相同,中华按蚊实验株的ITS2区段序列有472bp,与中华按蚊现场株的ITS2区段序列也相同;但嗜人按蚊和中华按蚊的ITS2区段基因序列存在明显差异并存在不同的限制性内切酶位点.结论可依据中华按蚊和嗜人按蚊的ITS 2基因序列内限制性内切酶切位点不同的基因特征,采用PCR-RFLP技术建立中华按蚊和嗜人按蚊基因鉴别技术.
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淡色库蚊rDNA-ITS2基因的克隆分析
目的 克隆并鉴定淡色库蚊核糖体DNA第二内转录间隔区(rDNA-ITS2)基因并应用于现场孽生蚊媒的种属鉴定,从而为孽生现场的蚊媒预警提供分子生物学依据.方法设计淡色库蚊诊断性引物分别对淡色库蚊实验室标准株及从现场采集的蚊虫的rDNA-ITS2序列进行PCR扩增,PCR产物纯化后连接到pGEM-Teasy载体上并转化到DH5α菌中,然后对其进行DNA序列测定及分析.结果成功克隆了淡色库蚊的rDNA-ITS2基因.序列分析结果表明,实验中所克隆到的淡色库蚊的rDNA-ITS2序列与GenBank所登录的淡色库蚊的rDNA-ITS2序列同源性均为98%以上,同时发现孽生现场存在淡色库蚊.结论 rDNA-ITS2序列在淡色库蚊中具有种属特异性,可为孽生现场的蚊媒预警提供分子生物学依据.
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核酸序列分析在真菌分类鉴定中的应用
传统的真菌分类鉴定以其形态学特征、生长特性以及生理生化指标为基础,然而真菌的形态特征复杂,且其生长特性和生理生化指标随着环境的变化而不稳定.
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核糖体DNA ITS序列分析在药用植物研究中的应用
药用植物核rDNA是高度重复的串联序列,由于同步进化的力量,大多数物种中这些重复单位间已发生纯合或接近纯合.5.8SrDNA把核rDNA的内转录间隔区分为ITS1和ITS2两部分.由于ITS序列变异较快,能够提供较丰富的变异位点和信息位点,已在药用植物鉴别、道地性研究、栽培与野生药用植物遗传差异分析、较低分类阶元的系统发育和分类研究中发挥重要作用.
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蒲公英属植物rDNA ITS序列测定及分析
目的 研究蒲公英属内4种植物的rDNA ITS序列遗传差异性,为探讨蒲公英属植物的系统演化关系、分类、品种鉴定提供DNA分子依据.方法 提取不同产地的蒲公英总DNA,以核糖体基因组ITS通用引物为引物进行扩增,扩增产物经纯化后,用PCR产物直接测序法进行测序.结果 蒲公英属植物ITS序列总长度约为641～642 bp,其中ITS -1长度为255 ～256 bp,5.8S长度为162 bp,ITS -2长度为224 bp.序列间共有23个变异位点.运用DNA Star软件进行系统分析得到蒲公莫属内4种植物的系统进化树,这一分析结果与来自形态学的研究结果基本吻合.结论 此法可用于蒲公英属植物种间及真伪品鉴别.
