新疆4种绢蒿属植物及近缘种银蒿的ITS/ITS2条形码鉴定研究

目的:评价ITS/ITS2热点条形码序列对新疆4种绢蒿属植物及其近缘种银蒿的鉴别能力,为绢蒿属植物分类鉴定提供分子参考依据.方法:对15份绢蒿属及银蒿植物样本进行DNA提取、PCR扩增、双向测序,采用CodonCode Aligner软件对序列峰图进行校对拼接,MEGA6.0分析序列碱基组成及变异,计算K2P遗传距离并构建聚类邻接树,预测ITS2序列二级结构,评估鉴别能力.结果:西北绢蒿、针裂叶绢蒿种内变异位点及信息位点数均小于银蒿.ITS序列种间、种内遗传变异均大于ITS2序列.ITS/ITS2序列邻接(NJ)树均聚为3支,绢蒿属、银蒿1、银蒿2.绢蒿属ITS2序列二级结构与银蒿有差异.结论:通过ITS/ITS2序列的种间K2P遗传距离、邻接树、ITS2序列二级结构分析,ITS、ITS2序列具很好的属鉴定效果,不同产地的针裂叶绢蒿被区分开.

基于ITS序列位点特异性PCR鉴别桃仁与苦杏仁

目的:对桃仁和苦杏仁进行分子鉴定研究,建立基于ITS序列位点特异性的PCR鉴定方法.方法:收集桃仁、苦杏仁样品,提取基因组总DNA,用ITS通用引物进行测序,通过BioEdit软件进行序列比对,根据特异位点设计鉴别引物进行特异性PCR反应,并对PCR反应条件进行了优化.结果:基于ITS序列设计的特异性鉴别引物G4-7可以用于桃仁和苦杏仁的鉴别研究,在位点特异性PCR反应条件考察中,25 μL反应体系DNA模板用量适宜范围为0.05 ～1 ng,退火温度在59℃时特异性佳,实验建立的方法对不同DNA聚合酶和PCR仪均具有普适性.结论:该研究设计的位点特异性引物在一定条件下的PCR反应中,桃仁能够扩增出333 bp清晰条带,而苦杏仁没有该条带,从而实现了桃仁与苦杏仁的快速、准确鉴别.

基于ITS序列的伞菌类药用食用真菌的DNA条形码鉴定研究

目的:伞菌类真菌物种繁多、生物多样性丰富,包括多种重要的药用、食用真菌以及有毒真菌.因此,对该类群的快速、准确鉴定,对于新的药用食用真菌资源的发现,以及对真菌毒素危害的防治都具有重要意义.方法:本研究以伞菌类13个科23个属50个物种,共计84份样本的真菌为研究对象,采用真菌通用引物ITS5和ITS4,对其核糖体DNA的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)进行PCR扩增和测序.通过比较不同真菌的序列长度、碱基构成,同时利用BLAST比对法和建树法对其进行鉴定.结果:伞菌类真菌的序列长度在463～751 bp之间,平均GC含量在37.1％～59.4％之间.通过与GenBank中序列的比对分析以及系统进化邻接(Neighbor-joining,NJ)树结果,可以在种级水平上鉴定各个真菌物种.结论:基于ITS序列的DNA条形码可以快速、准确鉴定伞菌类真菌,具有重要的应用价值.

药用多孔菌DNA条形码鉴定研究

目的:筛选采用DNA条形码技术鉴定药用多孔菌的有效条形码及该方法的可行性.方法:对29种药用多孔菌的69份样品进行DNA提取,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增ITS序列并进行双向测序,去除低质量区和引物区,得到ITS序列,通过BLAST比对及基于K2P遗传距离构建系统聚类NJ树开展ITS鉴定效率评价.结果:经过优化的DNA提取方法,可对所有样品成功提取到足量DNA,PCR扩增产物测序并经过序列拼接剪切后均能得到高质量ITS序列;物种内ITS大遗传距离均远小于物种种间小遗传距离;基于GenBank数据库进行BLAST比对,鉴定效率达到100％;基于K2P遗传距离构建NJ树,结果显示相同物种均聚为一支.结论:DNA条形码技术可以对多孔菌进行快速准确鉴定,ITS序列可作为药用多孔菌有效候选DNA条形码.

基于ITS序列鉴别真菌类药材马勃及其混伪品

目的:运用ITS序列鉴别真菌类药材马勃Lasiosphaera calvatia及其混伪品.方法:收集来自重庆、北京等9个地方的21份脱皮马勃、大马勃、紫色马勃样品,提取基因组DNA,经PCR扩增后双向测序.同时从GenBank上下载常见马勃药材混伪品的序列.将所有序列进行剪切校准拼接后分析,基于K2P(Kimura 2-Parameter)模型计算马勃及其混伪品的种内和种间遗传距离,并构建Neighbor-Joining(NJ)系统聚类树.结果:大马勃的ITS序列种内大K2P遗传距离为0;脱皮马勃的ITS序列种内大K2P遗传距离为0.003;紫色马勃的ITS序列种内大遗传距离为0.003.大马勃与混伪品种间小K2P遗传距离为0.019,脱皮马勃与混伪品种间小K2P遗传距离为0.031,紫色马勃与混伪品种间小K2P遗传距离为0.634.大马勃、脱皮马勃、紫色马勃的种内大遗传距离均小于它们与混伪品的种间小遗传距离.NJ树结果显示大马勃、紫色马勃、脱皮马勃各自聚为一支,表现出良好的单系性,能够与混伪品明显的区别开来.结论:基于ITS序列的条形码技术可以将马勃药材及其混伪品有效进行鉴别.

藏药材榜嘎及其混伪品的DNA条形码鉴定研究

目的:利用DNA条形码技术对榜嘎及其混伪品进行鉴别,为藏药榜嘎的鉴定提供准确可靠的依据.方法:通过分析榜嘎及其混伪品ITS和ITS2序列的遗传距离、种内种间变异并构建NJ系统发育树,以评价ITS2和ITS序列的鉴定效率.结果:本研究中ITS2和ITS序列扩增效率相同,在blast比对和遗传距离距离分析上,ITS序列表现出更强的鉴定能力;通过K2P距离构建NJ树,ITS2和ITS序列在榜嘎与混伪品间的种间变异无统计学意义,但ITS序列对易混物种的鉴定效率较高.结论:ITS序列可作为鉴定榜嘎及其混伪品的有效条形码.

不同产地丹参ITS序列及有效成分差异分析

目的:比较不同产地丹参的ITS序列差异,并结合其有效成分含量,分析ITS序列、有效成分含量与产地之间的关系,为探索不同产地丹参质量差异机制奠定基础.方法:提取不同产地丹参样品DNA,采用PCR-测序技术,应用序列分析软件分析各个产地之间ITS序列差异.采用UPLC方法检测不同产地丹参有效成分含量.结果:发现不同产地丹参ITS序列在152 bp处存在变异位点,且经诱导子诱导后的ITS序列位点在152 bp处存在“A”和“G”两种变异类型;各地丹参有效成分含量存在差异.结论:初步得出不同诱导子诱导后丹参ITS序列152 bp处的变异导致更多“G”型转变;山东丹参分别经壳聚糖、水杨酸处理后水溶性成分均增加,联合诱导则对有效成分的增加无显著效用.

我国不同地区半夏rDNA序列分析

目的:研究我国不同地区半夏核糖体ITS碱基序列差异及其与其地理分布和外部形态的相关性.方法:运用PCR法对半夏ITS1-5.8S-ITS2序列扩增后直接测序,用软件CLUSTRAL 1.83和MEGA 3.1分析测序结果.结果:得到我国半夏主要的16个居群18个样本rDNA中的ITS和5.8S rDNA完全序列.ITS1,5.8S和ITS2序列长度分别为276,162,246 bp.ITS2碱基频率差异显著,ITS1较为保守.根据两者序列以邻接法建立分子系统发生树.结论:半夏rDNA变异与其地理分布相关,与其外部形态关系有待进一步研究.

ITS2和psbA-trnH序列鉴别马鞭草科药用植物

目的:评价几条热点DNA条形码候选序列对马鞭草科药用植物的鉴别能力.方法:选择psbA-trnH,rbcL,marK,ITS2和ITS序列进行评价,使用各序列的通用引物进行扩增和测序,用扩增及测序成功率,种内种间差异,barcoding gap,基于BLAST 1和Nearest Distance方法的鉴定成功率等指标来评价各序列的鉴定能力.结果:对马鞭草科32个种55个样本的序列分析发现,,matK的扩增成功率太低,未纳入后续分析;ITS,ITS2,psbA-trnH以及rbcL的扩增及测序成功率分别为83.6％,83.6％,96.4％,98.2％,其鉴定成功率除rbcL为77.8％,75.9％外都为100％,但ITS2序列的种间,种内差异,barcoding gap较psbA-trnH,ITS有明显优势.ITS2序列进一步纳入网上163个样品的数据后其鉴定成功率依然可以达到89.5％,87.6％.结论:考虑到psbA-trnH较高的测序成功率,ITS2和psbA-trnH是适合马鞭草科植物鉴别的一个较好DNA条形码序列组合.

罂粟属植物核心DNA条形码的筛选

DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种准确、高效且对操作人员要求不高的物种鉴定技术.为了筛选出适合罂粟属的DNA条形码,从GenBank上获得罂粟属植物共69条序列,包括21条ITS序列,10条matK序列,8条psbA-trnH序列,14条rbcL序列和16条trnL-trnF序列.应用Mega 6.0软件分析了罂粟属的ITS,matK,psbA-trnH,rbcL,trnL-trnF序列的特征,通过计算序列的种内、种间距离,评估序列的Barcoding Gap和构建NJ,UPGMA系统发育树进行分析.分析结果表明:trnL-trnF不仅种内变异和种间变异差别大,而且有明显的barcoding gap,种内变异和种间变异重合较少,能较好地区分不同种类的罂粟;所构建的NJ和UPGMA系统发育树,也能将全部物种区分开.综合考虑,建议把trnL-trnF作为鉴定罂粟属植物的核心条形码,结合其他片段作为组合条形码.

羌活不同地理种群ITS序列变异及系统发生分析

利用核糖体rRNA基因内转录间隔区(ITS)序列,对我国羌活31个野生群体的遗传结构进行了分析.经PCR扩增测序,获得长度为634 ～635 bp的ITS核苷酸序列,其平均G+C量(57.8％)显著高于A+T量.在羌活31个居群402条序列中共检测到31个变异位点,多态位点比例为4.88％,其中,简约信息位点为12个,共有31种单倍型.AMOVA分析结果显示:羌活大部分的遗传变异发生在居群间(57％).以宽叶羌活为外群构建的NJ树显示:31个单倍型并没有按地理分布形成明显的族群,各地理单元中的单倍型相互混杂,没有明显的地理分化模式.

不同产地杜仲皮内生真菌种群结构的比较分析

为探讨不同产地杜仲皮内生真菌种群结构的差异,采用平板分离法分离来自慈利、略阳和遵义3个产地杜仲皮内生真菌,通过形态和分子手段相结合的方式对分离出的真菌进行鉴定,共分离得到152株内生真菌,分属于8个属,其中Phomopsis,Diaporthe,Alternaria为3个产地内生真菌共有属,各产地的优势种群不同.相似性分析表明,不同产地杜仲皮内生真菌的组成结构上存在差异;多样性及均匀度分析表明,慈利和略阳产地杜仲皮内生真菌种群多样性较高,分布较均匀.遵义产地杜仲皮内生真菌种群的多样性指数及均匀度指数低,优势种群集中,奇异度较高.拟茎点菌属与其有性态间座壳属菌株的系统发育及遗传距离分析,不同产地杜仲皮中拟茎点菌属及其有性态真菌多样性丰富.综合分析认为,杜仲皮组织的内生真菌具有多样性,慈利、遵义和略阳3个产地内生真菌的数量、组成及种群间存在显著差异.

贝母类药材湖北贝母Fritillaria hupehensis系统位置的探讨——来自ITS,rpl16,matK序列的证据

湖北贝母为传统中药,然而《Flora of China》将其基原植物湖北贝母Fritillaria hupehensis归并于天目贝母F.monantha项下.该实验采用分子系统学方法,以川百合Lilium davidii为外类群,用核基因ITS序列和叶绿体基因rpl16序列、matK序列等3个片段对湖北贝母及其近缘类群天目贝母F.monantha、安徽贝母F.anhuiensis等进行联合建树分析,对湖北贝母植物的系统位置进行了探讨,为湖北贝母药材的安全使用提供分子证据.结果显示,分子系统树上,3种贝母各自的居群聚为一支,之后天目贝母与安徽贝母聚为一支,后与湖北贝母聚为一支.表明湖北贝母与天目贝母的亲缘关系可能要远于安徽贝母与天目贝母之间的关系,因此不适宜将湖北贝母归并于天目贝母.

绞股蓝属植物亲缘关系初步分析

采用DNA条形码ITS,matK,rbcL,psbA-trnH 4个片段,对绞股蓝属Gynostemma 9个种及变种共38份样品的序列进行分析,以雪胆属罗锅底Hemsleya macrosperma作为外类群,运用PAUP 4.0b10软件进行系统发育分析,基于ITS序列采用邻接法(NJ)和大简约法(MP)构建系统发育树,探讨绞股蓝属下的亲缘关系.研究表明:①在NJ树和严格一致树中,广布种绞股蓝G.pentaphyllum var.pentaphyllum的8个个体没有形成单系分支;②怀疑长梗绞股蓝G.longipes和光叶绞股蓝G.laxum是否应为独立的种;③支持绞股蓝属植物亚属的分类单位.

ObjectivePoisonous plants are a deadly threat to public health in China. The traditional clinical diagnosis of the toxic plants isinefficient, fallible, and dependent upon experts. In this study, we tested the performance of DNA barcodes for identification of the most threatening poisonous plants in China. MethodsSeventy-four accessions of 27 toxic plant species in 22 genera and 17 families were sampled andthree DNA barcodes (matK,rbcL, and ITS) were amplified, sequenced and tested.Three methods, Blast,pairwise global alignment (PWG)distance, and Tree-Building were tested for discrimination power. ResultsThe primer universality of all the three markers was high. Except in the case of ITS for Hemerocallisminor, the three barcodes were successfully generated from all the selected species. Among the three methodsapplied, Blast showed the lowest discrimination rate,whereasPWGDistance and Tree-Building methods were equally effective. The ITS barcode showed highest discrimination rates using the PWG Distance and Tree-Building methods. When the barcodes were combined, discrimination rates were increased for the Blast method. ConclusionDNA barcoding technique provides us a fast tool for clinical identification of poisonous plants in China.We suggestmatK,rbcL, ITS used in combination as DNA barcodes for authentication of poisonous plants.

福建省五条蚋和黄毛纺蚋nrDNA-ITS序列分析(双翅目:蚋科)

克隆并测定福建省五条蚋Simulium (Simulium) quinquestriatum和黄毛纺蚋Simulium (Nevermannia)aureohirtum nrDNA-ITS序列,分别与GenBank中发表的Simulium亚属和Nevermannia亚属序列进行系统进化树分析,探讨其在蚋类分子分类中的作用.结果表明,各蚋种克隆株ITS2序列均与相应物种聚类,符合形态学鉴定结果,可作为蚋种鉴定和近缘种类鉴别的遗传标记之一;ITS1序列在五条蚋中同源性较低(88.3%),不适合做分类遗传标记;黄毛纺蚋泉州、漳浦两地理株间存在变异.

西方角蝇和截脉角蝇rDNA的ITS基因序列对比研究

为了解决传统方法研究蝇类传播媒介费时费力及难以准确鉴定其幼虫等问题,本研究以采自内蒙古北部戈壁地区骆驼及其粪便上的西方角蝇和截脉角蝇为研究对象,将2种角蝇rDNA的ITS序列片段进行了测序分析.运用DNAStar 5.0软件中的MegAlign工具和Clustal W程序,对2种角蝇的ITS序列进行了分析.结果表明,西方角蝇扩增的ITS片段大小为1 047 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITSI(464 bp)、5S(122 bp)、ITS2a(29 bp)、2S(30 bp)和ITS2(349 bp)序列;截脉角蝇扩增的ITS片段大小为1 015 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITSI(457 bp)、5S(122 bp)、ITS2a(29 bp)、2S(30 bp)和ITS2(324 bp)序列.2种角蝇的ITS序列(去掉18S及28S部分后)差异显著,有190个识别位点,差异性达到14.9%.上述结果为进一步研究西方角蝇和截脉角蝇的分子生物学特性奠定了重要基础.

临床常见镰刀菌rDNA ITS序列分析

目的探讨rDNA ITS序列分析用于快速鉴定临床常见镰刀菌的方法,为临床早期诊断镰刀菌感染提供依据.方法选择临床常见的茄病镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌和半裸镰刀菌,提取基因组DNA,用真菌通用引物ITS1、ITS4、PCR扩增rDNA ITS,纯化后测定其序列,所得序列在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索,并和其中镰刀菌标准株的rDNA ITS序列进行序列比对.利用Clustal X软件将序列匹配排列,进行1000次bootstrap统计学检验,用TreeView软件显示系统树.结果 rDNA ITS序列分析的结果与表型基本一致,以前经形态学鉴定的2株串珠镰刀菌经过rDNA ITS序列分析鉴定为层生镰刀菌.系统树显示茄病镰刀菌和标准株聚在一起,串珠镰刀菌大部分也和标准株聚在一起.结论形态学鉴定镰刀菌有一定的局限性,rDNA ITS序列分析可用于快速鉴定临床常见的镰刀菌.

柴胡属药用植物的分子鉴定及市售柴胡药材的质量调查

柴胡是常用的大宗中药材之一,在我国有着两千多年的药用历史.但是目前柴胡药材品种混乱,有25种、8变种、3变型的柴胡属药用植物在不同地区和中药材市场作为柴胡使用,通过传统方法鉴别极为困难.为快速准确地对柴胡属为数众多的药用植物进行鉴定,本文从全国9省份14居群采集了168株柴胡属药用植物,扩增获得了长度为600～606 bp的ITS序列;通过DNAMAN比对分析找到86个变异位点,并确定了19种ITS单倍型(TH1～TH19);利用MEGA 5.0进行K2P (Kimura 2-parameter)遗传距离分析,发现种间遗传距离显著大于种内遗传距离;利用邻接(neighbor joining,NJ)法构建系统发育树,显示各物种聚类关系清晰,因此建立了基于ITS序列的柴胡属药用植物分子鉴定方法.利用该方法对来自全国5个主要中药材市场的52份柴胡药材进行了分子鉴定,并进一步利用HPLC法测定各药材中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c及柴胡皂苷d的含量,应用ANOVA和LSD T检验进行统计学分析,从而对市售柴胡药材的质量进行评价.本文不仅对柴胡属药用植物的快速准确鉴定具有重要意义,而且对于掌握市场上柴胡药材的流通现状及质量评价具有指导意义.

基于DNA条形码的百合属分子鉴定

本文通过实验,并结合GenBank数据库序列,分析ITS、ITS2、psbA-trnH、matK、rbcL 5条常用条形码共978条序列在种内与种间变异、barcoding gap、系统发育树等方面对百合属植物的鉴别能力,并采用近距离法(nearest distance)和相似性搜索算法(BLAST1)评价5条序列的鉴定成功率.研究结果显示,不同条形码序列可以较好的鉴别百合属内不同物种.ITS序列鉴定成功率较高,种内种间差异显著,系统发育树可以很好地将不同物种分开.结果表明DNA条形码技术可以准确地鉴别百合属植物,ITS序列可以作为鉴别百合属不同物种的优选序列.