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临床常见镰刀菌rDNA ITS序列分析
目的探讨rDNA ITS序列分析用于快速鉴定临床常见镰刀菌的方法,为临床早期诊断镰刀菌感染提供依据.方法选择临床常见的茄病镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌和半裸镰刀菌,提取基因组DNA,用真菌通用引物ITS1、ITS4、PCR扩增rDNA ITS,纯化后测定其序列,所得序列在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索,并和其中镰刀菌标准株的rDNA ITS序列进行序列比对.利用Clustal X软件将序列匹配排列,进行1000次bootstrap统计学检验,用TreeView软件显示系统树.结果 rDNA ITS序列分析的结果与表型基本一致,以前经形态学鉴定的2株串珠镰刀菌经过rDNA ITS序列分析鉴定为层生镰刀菌.系统树显示茄病镰刀菌和标准株聚在一起,串珠镰刀菌大部分也和标准株聚在一起.结论形态学鉴定镰刀菌有一定的局限性,rDNA ITS序列分析可用于快速鉴定临床常见的镰刀菌.
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产孢丝状真菌NCCLS药敏试验方法的应用
美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)于1997年推出了关于酵母菌的液体培养基稀释(多量法与微量法)抗真菌药敏试验方案M27-A,建立了被众多实验室认同的重复性好、准确性较高的标准化体外药敏试验方法。但由于丝状真菌本身的诸多特点如产孢条件难以控制、接种量难以精确量化、孵育时间长等,使其试验方法标准化具有一定难度。近年来NCCLS分会成员以M27-A的微量法为基础进行了多中心广泛深入研究[1,2],于1998年提出了《产孢丝状真菌的液基稀释抗真菌药敏试验参考方案》(M38-P)。该方案在提出了一些建设性意见的同时,重申了多量法与微量法的一致性。现将其方法简介如下。 一、材料和方法 1.抗真菌药物:测试用药物包括氟康唑(FCZ),5-氟胞啶(5-FC)、酮康唑(KCZ)、伊曲康唑(ICZ)和两性霉素B(AmB)。药物来源、贮备液的制备等同M-27方案[3]。 2.被检测的真菌:本方案主要针对常见侵袭性真菌感染的菌种:曲霉、镰刀霉、根霉,波氏假阿利什霉及申克孢子丝菌的菌丝相。不包括其他非产孢丝状真菌,也不适应于双相真菌的酵母相。 3.培养基:建议应用RPMI-1640培养基,配制方法要求同M27-A方案。 4.真菌接种液的制备:(1)为保证受试菌的纯度及活性,需在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上35℃培养7 d或35℃培养48~72 h后,转至25~28℃至7 d(镰刀菌)。(2)取1 ml无菌0.85%盐水加入培养7 d的培养皿中,用巴氏吸管轻轻抽吸,制备菌悬液(加入1滴吐温20将有利于曲霉的接种),将菌悬液吸至无菌试管中,静置3~5 min后,取上部匀质液体(含孢子或孢子囊孢子和菌丝片断),在振荡器上振荡15 s。(3)用分光光度计调整菌悬液浓度,波长530 nm,A值曲霉、申克孢子丝菌0.09~0.11,镰刀霉、波氏假阿利什霉及根霉0.15~0.17。(4)将上述菌悬液用RPMI-1640稀释50倍得2倍终浓度(0.4~5×104)的菌悬液备用。(5)为保证试验准确性应做菌落计数,取0.01 ml终浓度菌悬液接种于改良的沙氏萄葡糖琼脂培养基的平皿中(28~30℃),每天观察并计数肉眼可见的真菌菌落(尤其是对于镰刀菌),孵育时间为24 h以内(镰刀菌)至5 d(波氏霉)。 5.液体培养基的接种:在96孔板的1~10列孔中每孔加入0.1 ml的2倍终浓度的菌悬液。每次试验均应包括质控、参考菌株。 6.培养:35℃条件下(不要摇动)大多数菌需46~60 h判定低抑菌浓度(MIC)结果,根霉则需21~26 h,波氏假阿利什霉则需70~74h。
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镰刀菌不是毛霉病的病原菌
编辑同志:贵刊于2007年6期第694~695页刊登了<镰刀菌致毛霉菌性肺炎一例>一文[1],介绍了黄卫青等在工作中遇到的1例系统性真菌感染的病例,该文对增强读者的真菌感染防治意识、了解镰刀菌感染的特点可以起到积极作用.但是,该文从题目到内容中均存在对真菌感染基本认识上的失误,特在此撰文予以说明.
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儿童急性淋巴细胞白血病并发镰刀菌败血症
患儿男,4岁,2011年4月出现反复发热,2011年7月10日来我院初诊,实验室检查:WBC 20.7×109/L、Hb 103 g/L、PLT 44×109/L.骨髓细胞形态学、免疫学、细胞和分子遗传学(MICM分型)诊断急性淋巴细胞白血病.予诱导方案VDLP(长春新碱+柔红霉素+门冬酰胺酶+泼尼松)化疗.化疗中出现骨髓抑制,2011年7月18日实验室检查:WBC 0.6×109/L、Hb 65 g/L、PLT37×109/L,予粒细胞集落刺激因子(G-CSF)促进造血功能恢复.诱导化疗第18天出现高热,体检发现右手留置针针眼处有脓点;血常规:WBC O.37×109/L、中性粒细胞0.01× 109/L、Hb 88 g/L、PLT 44×109/L;超敏C-反应蛋白(hs-CRP)36 mg/L;血培养阴性.予亚胺培南西司他丁钠联合万古霉素抗细菌感染,伊曲康唑预防真菌感染.治疗第3天出现皮肤红色斑丘疹,以四肢伸侧为主,触痛明显,1~2d后部分皮疹中心部分开始坏死,复查骨髓提示:骨髓有核细胞增生极度减低;肺CT正常;心脏及腹部彩超正常.
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镰刀菌基因分型及临床应用的研究进展
镰刀菌性角膜炎是严重的致盲性角膜病.由于镰刀菌种属之间的生物学特性、致病性和耐药性存在较大差异,依靠传统的形态学方法对镰刀菌菌种分型不能满足现代临床诊疗的需要,而基因分型方法利用分子生物学技术,如RAPD、RFLP、SSCP、PAGE及DNA测序等,能从分子背景上反映生物间的差异,较传统方法具有重复性好、特异性强、分辨力高等优势,已广泛用于真菌菌株的分类分型、亲缘关系鉴定等研究中.研究致病性镰刀菌的基因型及其与临床表现的关系,对深入探讨镰刀菌角膜感染的发病机制和探索新的治疗方法具有重要意义.
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角膜致病性丝状真菌药敏纸片扩散法与微量稀释法的对比研究
目的 对比临床常用的纸片扩散法与标准微量稀释法检测丝状真菌体外药物敏感的一致性.设计实验性研究.研究对象镰刀菌属20株和曲霉菌属18株,均分离自北京同仁医院眼科中心送检的角膜标本.方法 用纸片扩散法与NCCLS提出的微量稀释法(M38-P方案)平行检测丝状真菌体外药物的敏感性,对比两种方法结果的一致性.参试药物包括那他霉素、特比萘芬、两性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶、咪康唑、酮康唑.主要指标纸片扩散法的抑菌环直径(mm)和微量稀释法的小抑菌浓度(μg/ml).结果 纸片扩散法与微量稀释法对比发现:对于镰刀菌属,两者结果的符合率大于80%者有:那他霉素(100%)、伊曲康唑(100%)、氟胞嘧啶(100%)、两性霉素B(88%)、咪康唑(85%)、氟康唑(85%)、酮康唑(80%);符合率低于80%者有:特比萘芬(0%).对于曲霉菌属,符合率大于80%者有:氟康唑(100%)、咪康唑(97%)、特比萘芬(94%)、酮康唑(94%)、氟胞嘧啶(83%);符合率低于80%者有:那他霉素(72%)、伊曲康唑(72%)、两性霉素B(67%).结论 纸片扩散法与微量稀释法检测多数药物的一致性较高.由于纸片扩散法具有简便、快速等优点,适用于眼科实验室.
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伏立康唑治疗超声乳化白内障吸除术后镰刀菌性眼内炎一例
白内障术后真菌性眼内炎是严重的手术并发症,治疗效果差,尤其镰刀菌性眼内炎既往没有特效药物,患者几乎均需摘除眼球.本院2007年遇到1例超声乳化白内障吸除术后镰刀菌性眼内炎,经伏立康唑治疗后好转的病例,现报道如下……
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真菌孢子黏附和基质金属蛋白酶在角膜真菌感染中的作用
镰刀菌、曲霉菌、念珠菌及青霉菌为真菌性角膜炎主要感染菌属,不同菌种在角膜中表现出不同的病理损害特征,其机制尚不详[1].本实验选取上述4种真菌,探讨黏附和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)在角膜真菌感染中的作用.
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镰刀菌和曲霉菌性角膜溃疡的组织病理学特点
真菌性角膜炎的致病菌种类多,常见的有镰刀菌、曲霉菌、念珠菌等[1],不同真菌的生物学特性和致病机制不同.真菌通过机械性损伤、产毒性和强大的酶系统,可引起严重的角膜溃疡,常导致角膜穿孔、眼内炎等并发症[1];我国以镰刀菌和曲霉菌感染占大多数[2].
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真菌性角膜炎常见致病菌株——镰刀菌的AFLP指纹图谱分析
目的 采用AFLP对镰刀菌进行基因分型.方法 对镰刀菌分离、纯化、重新鉴定后,用CTAB法提取其DNA.经EcoRI和MseI双酶切,对酶切片段进行预扩增和选择性扩增.扩增后的产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳.银染成像.结果 用20株镰刀菌作材料.筛选出3对多态性较高.带型质量较好的AFLP引物,分别是E-TCM-CAA,E-TAM-ClYr,E--TA M-CAC.各菌株同的相似率为74%~90%.在SM=0.74(74%)的相似性水平上,镰刀菌明显地分为2种.14株茄病镰刀菌种内可分为9型,6株串珠镰刀菌种内可分为4型.结论 AFLP可用于真菌性角膜炎常见致病菌株即镰刀菌的基因分型.
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氟康唑治疗真菌性角膜炎3例报告
真菌性角膜溃疡是一种比较难治的化脓性角膜溃疡,常导致整个角膜坏死而失明,是一种致盲率很高的感染性疾病,主要致病菌为曲霉菌、白色念珠菌、镰刀菌、青霉菌等.随着眼外伤增多,广谱抗生素、糖皮质激素的广泛应用,眼部真菌感染越来越多,大多数抗真菌药物毒性大,穿透眼组织能力弱,效果不佳.我院于2004年诊治3例真菌性角膜炎,现将其临床表现和治疗情况报告如下:
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黄芪根腐病研究概况
黄芪为豆科多年生草本植物,以根入药,性温、味甘,具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、排脓生肌的功效.是药用价值很高的中药材.通过研究黄芪根腐病发病特点及症状、病原微生物、发病规律及影响因素,可以看出黄芪种植要求严格,应该从农业和药剂两方面同时采取措施,综合治理,从而在一定程度上预防根腐病的发生.
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玉米中伏马菌素B1高效液相色谱检测
伏马菌素(fumonisin,FB)是近年来发现的一组镰刀菌产生的真菌毒素,其中FB1是污染玉米的主要成分,也是导致伏马菌素毒性作用的主要原因,广泛存在于世界范围的玉米及其制品中,对人类健康和畜牧业发展构成潜在威胁,成为真菌毒素中继黄曲霉毒素后的又一个研究热点[1].
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那它欣治疗真菌性角膜溃疡
关于那它欣治疗真菌性角膜溃疡,国内尚未见报导,于2000年1~3月我院应用那它欣治疗真菌性角膜溃疡4例,获得满意疗效.本文4例中男3例,女1例,年龄23~67岁,均为农民.病史13~42天.植物性外伤史2例,病毒性角膜炎合并感染1例,不明原因者1例,均经当地医院多方治疗无效,病情逐渐加重而来我院.结膜囊分泌物及角膜坏死组织刮片检查.见真菌菌丝4例;真菌培养4例有真菌生长者2例,其中曲霉菌1例,镰刀菌1例.
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流式细胞术用于眼部镰刀菌药物敏感性检测的初步探讨
目的 探讨应用流式细胞技术测定眼部常见真菌对抗真菌药物敏感性的可行性.方法 用流式细胞术药敏试验(Flow Cytometry Susceptibility Testing,FCST)和标准药敏试验(肉汤稀释法M38-A)法检测1株标准镰刀菌和23株临床镰刀菌对两性霉素B(AMB)的敏感性.FCST法以碘化丙啶(PI)为染料,真菌与各浓度药物孵育3h后检洲各管平均荧光强度(MFI),低抑菌浓度(MIC)定义为相于生长对照管MFI增加50%时的低药物浓度.结果 两种检测方法有8株真菌的MIC完全相同,12株相差1个倍比稀释度,2株相差2个倍比稀释度,在1个稀释度范围内两种检测方法的一致性为83.3%,2个稀释度范围的一致性为91.6%.两组结果无统计学差异(P=0.5685).结论 FCST法检测眼部镰刀菌对抗真菌药物的敏感性所得结果与标准法所得结果有良好的一致性,且FCST法具有快速、敏感、准确的优势,是临床检测丝状菌药物敏感性较具发展潜力的一种新方法.
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1例肺镰刀菌病患者的护理
目的:探讨肺镰刀菌病患者的临床护理方法,提高治愈率。方法对收治的1例肺镰刀菌病患者观察病情变化,制定合理的护理措施。结果患者临床死亡。结论对肺镰刀菌病患者采取积极有效的观察和护理,可减少并发症的发生,减轻患者痛苦。
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T-2毒素致大骨节病软骨损伤的研究进展
T-2毒素是镰刀菌所产生的单端孢霉烯族毒素中毒性强的一种,它是1968年发现并报告的,其化学名字为T-2 toxin(3-Hydroxy-4,15-diacetoxy-8-[3-methylbutyryloxy]-12,13-epoxytrichothec-9-ene),分子量466.2,分子式C24H34O9,熔点151℃~152℃.
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应用酶免疫检测法检测T-2毒素的研究进展
单端孢酶烯族真菌毒素是由多种农作物致病菌,如镰刀菌、单端孢霉、木霉等产生的一组倍半萜烯类化合物[1].其中对人畜危害大的主要是T-2毒素[2],该毒素能抑制蛋白质及DNA的合成,干扰生物体能量代谢,对快速增殖的细胞、组织,如皮肤、肠粘膜、白细胞等有类放射性效应[3].
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粮食的不同状态对T-2毒素生成的影响
大量的观察发现,粉状粮与粒状粮中T-2毒素含量有明显差异[1,2],粉状粮如玉米粉,面粉中T-2毒素污染阳性率高、含量大,粒状粮玉米粒、大米、小米中T-2毒素污染阳性率低、含量小.粉状粮和粒状粮T-2毒素含量的这种差异可能来源于制粉这一过程,有报告认为,制粉过程类同于人工接种,这一过程可使粮食与镰刀菌充分混合,因而适宜其大量产毒[3].但未见有系统的实验观察.
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新疆地区老年真菌性角膜炎致病镰刀菌的基因型和体外药物敏感性
目的 研究新疆地区老年真菌性角膜炎分离镰刀菌的基因型和药物敏感性.方法 老年真菌性角膜炎患者角膜中分离得到的镰刀菌758株,采用部分EF1-α基因序列比对鉴定镰刀菌菌种和基因型;采用CLSI研究所M38方案测定鉴定出的镰刀菌对两性霉素B、氟康唑等11种常用抗真菌药物的低抑菌浓度(MIC).结果 758株镰刀菌中经EF1-α基因序列共鉴定出644株,本地区以腐皮镰刀菌种复合体(FSSC)多,共包括15个菌种,43个基因型,常见基因型为FSSC5-d.赤霉菌种复合体(GFSC)位居第2,有3个菌种;尖孢镰刀菌复合体(FOSC)位居第3,有6个基因型.植物性外伤、眼部手术引起的外伤GFSC角膜炎发生率明显高于FSSC角膜炎(P<0.01).物理、化学因素引起的外伤GFSC角膜炎发生率明显低于FSSC角膜炎(P<0.05).体外药敏试验显示,镰刀菌对那他霉素、两性霉素B、伏立康唑敏感;对5-FC、制霉菌素、咪康唑、克霉唑耐药;FSSC感染的真菌性角膜炎对伏立康唑、特比萘芬、那他霉素的MIC50高出GFSC约2倍.结论 新疆地区老年真菌角膜炎患者中感染镰刀菌主要位于3个复合体FSSC、GFSC、FOSC中;植物性外伤、眼部手术易引起GFSC角膜炎,物理、化学因素外伤易引起FSSC角膜炎;不同种镰刀菌对伏立康唑、特比萘芬、那他霉素的药敏有差异.