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人工转录激活子样效应因子核酸酶与多位点基因打靶载体的构建与鉴定
目的 构建并验证针对人类基因组核糖体DNA(rDNA)序列的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)表达载体与人类通用多位点基因打靶载体.方法 运用在线软件TALENs Targeter在rDNA序列上设计TALEN切割位点,并构建针对该位点的TALEN表达载体,利用细胞转染技术,筛选出一对有较高活性的TALEN,并计算其切割效率.将TALEN切割位点两侧的同源重组引导序列DS1、DS2以及GFP表达元件克隆到pUC-19质粒中,终将TALEN与多位点基因打靶载体共转染293T细胞,经PCR与测序鉴定,对目的基因整合情况进行验证.结果 经酶切、测序鉴定,成功获得一对切割活性高达78.5%的TALEN(TALEN-L1R2),成功构建人类细胞通用的多位点基因打靶载体pUC-DS1-EGFP-DS2;两种技术结合后将目的基因GFP成功整合于293T细胞基因组中.结论 TALEN与多位点打靶技术结合,可有效将目的基因整合于基因组中.
关键词: 转录激活子样效应因子核酸酶 基因打靶 核糖体DNA -
从生命科学领域解读《Science》2012年度十大突破
2012年12月20日,美国
杂志公布了2012年度十大科学突破,领域涉及物理学、工程学、生命科学及其他科学.其中,生命科学领域的重要发现包括:"古人类DNA序列的完美呈现","基因组的巡航导弹","超越基因的基因组","X射线激光器测定蛋白质结构","脑机接口的成功应用"以及"干细胞诱导成为卵细胞".本文主要针对这六项突破进行解读. -
新一代基因组编辑技术在基因治疗及生物制药领域中的应用
近年来,随着锌指核酸酶、转录激活子样效应因子核酸酶和成簇可调控间隔短回文重复RNA引导核酸酶的出现,“基因组编辑”技术得到广泛应用.由于此类技术具有高效和可定制的特点,在基因治疗、细胞模型、糖基化工程、细胞工程等方面许多新策略、新方法不断涌现,产生了十分重要的影响.本文就近年来基因组编辑技术的发展及其在基因治疗和生物制药领域的应用进行综述.
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ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas9基因编辑技术在疾病研究及基因治疗中的应用
对基因组进行精确而有效的编辑修饰是生物学领域的重要探索内容。传统的基因操作手段由于效率、精确度低等问题,严重滞后于基因组研究的进展。近年来,新发展的基因编辑方法如锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR/Cas9)等通过特异性识别和切割基因组 DNA 序列,可以诱发同源重组或非同源末端链接,使基因编辑更灵活、高效,从而开启了生物学研究及人类疾病机制研究新的模式。这三种基因编辑工具能够在不同的生物体及细胞中有效、特异地实现基因修饰,尤其是在干细胞中的应用,为人类疾病的机制研究及治疗带来了极大的便利和潜能。本文主要介绍 ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas9方法的工作机制及其在人类疾病模型建立及基因治疗中的应用,同时展望了其未来的发展方向。