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创伤弧菌检测方法的研究进展
创伤弧菌是自然生存于河口和海洋环境中的一种可能致命的病原菌,建立灵敏、特异的检测方法对保护人类健康极为重要.本文详细描述了用于创伤弧菌检测的多种选择性培养基,并对传统生化方法、免疫学方法和DNA探针、PCR等基因检测方法进行了综述.
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32P与光敏生物素标记DNA探针在疟疾监测中的应用研究
本文报告了应用32P和光敏生物素标记克隆的pBF4DNA,作为探针,以斑点杂交试验,检测海南、云南和山东省的血样.两种标记探针检测结果与镜检的符合率分别为恶性疟98.6%和96.2%;间日疟91.6%和86.7%;正常人血95.2%和100%;并可从多种疟原虫标本中,特异地检出恶性疟原虫,显示探针具有恶生疟原虫的种特异性.检测的敏感度为84个原虫/μl血,检测原虫DNA可达10pg水平.表明探针具有良好的实用性.
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飞行时间质谱与TaqMan探针技术在结核病易感性相关基因单核苷酸多态性筛选中的应用
目的 对比分析飞行时间质谱技术(MALDI-TOF)和TaqMan探针筛选与结核病易感性相关单核苷酸多态性(SNP)位点的结果,以及联合应用的方法学和效果评价.方法 选取2010年10月至2011年4月在深圳市第三人民医院收治并确诊的结核病患者400例为结核病组,对照组为同时期收集的健康体检者300名,利用MALDI-TOF对选取的7个SNP位点(rs2227476、rs1800795、rs56077270、rs1800797、rs2227484、rs2227472和rs2227473)同时进行基因分型,初步筛选易感SNP位点;与结核病易感相关的单个SNP位点,采用基于TaqMan探针技术的实时荧光定量PCR对同样的标本再进行基因分型,比较两种方法的准确性与敏感度;以rs2227473位点为实例对分型结果的基因频率进行分析,确定肺结核的易感SNP.结果 MALDI-TOF分型成功率为99.7％(698/700),TaqMan探针技术为98.4％(689/700);在基因分型过程中,MALDI-TOF与TaqMan探针方法对1例标本的分型结果不一致,经过对此分型结果进行了测序验证,MALDI-TOF的分型结果正确,MALDI-TOF在准确性和敏感度比TaqMan法稍高.位点rs2227473基因频率分析中,结核病组G等位基因频率(90.3％,722/800)明显高于对照组(82.5％,495/600)(x2=6.911,P=0.009).结论 上述肺结核易感基因的筛选方法是可行的;实例分析中,将两种方法联合应用,发现了IL-22基因rs2227473位点等位基因G可能与肺结核发病相关,两位点中等位基因A可能为保护性基因.
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分子病理学诊断颈部淋巴结结核及其耐药性的应用价值
目的 评价分子病理学方法诊断颈部淋巴结结核及其耐药性的临床应用价值.方法 搜集2010年3月至2013年10月首都医科大学附属北京胸科医院病理科收治的符合纳入标准(临床症状和体征均符合颈部淋巴结结核、抗结核药物治疗均有效)的全部97例颈部淋巴结结核患者(结核组);以及符合纳入标准(通过病理学或临床检测结果明确诊断为其他淋巴结疾病)的全部20例其他淋巴结病变患者(非结核组)的石蜡包埋标本.所有标本以萋-尼(Z-N)抗酸染色法查找抗酸杆菌,荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)检测结核分枝杆菌特异基因序列IS6110;以临床后诊断为标准,比较两种方法的检测效能;并对FQ-PCR检查结果为阳性且结核分枝杆菌DNA含量满足耐药突变检测下限的标本,以探针熔解曲线法检测利福平、异烟肼耐药相关基因突变情况.结果 以临床后诊断为标准,抗酸染色和FQ-PCR检测结核组的敏感度分别为22.7％(22/97)和67.0％(65/97);FQ-PCR技术检测敏感度明显高于抗酸染色法,差异有统计学意义(x2=38.53,P＜0.001).抗酸染色和FQ-PCR检测非结核组标本均为阴性,特异度均为100.0％(20/20).抗酸染色和FQ-PCR的阳性预测值分别为100.0％(22/22)和100.0％(65/65),阴性预测值分别为21.1％(20/95)和38.5％(20/52),符合率分别为35.9％(42/117)和72.6％(85/117).对41例FQ-PCR检查结果为阳性且结核分枝杆菌DNA含量满足耐药突变检测下限的患者标本进行结核分枝杆菌耐药基因突变检测,利福平和异烟肼可评估标本分别为10份(例)和27份(例),其中利福平耐药1份(例),异烟肼耐药13份(例).结论 分子病理学诊断技术在颈部淋巴结结核石蜡包埋标本中检测结核分枝杆菌DNA的敏感度和特异度较高,并且能筛查可能的耐药患者,可为颈部淋巴结结核的正确诊断与合理化治疗提供依据.
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16S-23S rDNA间隔区序列PCR扩增及探针杂交用于偶然分支杆菌暴发感染的研究
目的从基因水平上确认福建省南平市注射后偶然分支杆菌暴发感染的致病菌,并建立PCR结合DNA探针杂交快速鉴定偶然分支杆菌的方案.方法根据偶然分支杆菌16S-23S rDNA间隔区序列,设计合成一段寡核苷酸探针,采用PCR扩增、RFLP和DNA斑点杂交技术,对29株偶然分支杆菌临床分离株进行鉴定.结果 29株偶然分支杆菌临床分离株均被PCR扩增出一条约470bp的DNA条带,DNA探针杂交也出现特异的杂交斑点.结论 16S-23S rDNA间隔区序列PCR扩增及DNA探针杂交在基因水平上确认引起此次注射后暴发感染的致病菌为偶然分支杆菌,该方法具有灵敏、特异的特点.
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结核分枝杆菌DNA指纹分析研究
目的:采用结核分枝杆菌IS6110-RFLP DNA分型的方法分析上海近年分离的部分结核分枝杆菌临床分离株,并进行分子流行病学分析.方法:提取结核分枝杆菌基因组DNA,纯化后经限制性内切酶Pvu Ⅱ切割、琼脂糖凝胶电泳和Southern转印后,用荧光标记的IS6110 DNA序列中245bp探针杂交,以核酸化学发光试剂盒探测荧光信号,比较各菌株指纹的IS6110拷贝数和带型,分析各菌株指纹的IS6110拷贝数和带型.结果:经245bp探针杂交后的指纹图谱显示大部分菌株含9-21个IS6110拷贝,但有1菌株不含IS6110拷贝,另一株含1个IS6110拷贝.结论:结核分枝杆菌上海分离株指纹图谱呈高度多态性.零拷贝菌株和单拷贝菌株不能用IS6110-RFLP DNA指纹分析方法分析.
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结核分枝杆菌DNA指纹分析研究
目的:采用结核分枝杆菌IS6110-RFLP DNA分型的方法分析上海近年分离的部分结核分枝杆菌临床分离株,并进行分子流行病学分析.方法:提取结核分枝杆菌基因组DNA,纯化后经限制性内切酶Pvu Ⅱ切割、琼脂糖凝胶电泳和Southern转印后,用荧光标记的IS6110 DNA序列中245bp探针杂交,以核酸化学发光试剂盒探测荧光信号,比较各菌株指纹的IS6110拷贝数和带型,分析各菌株指纹的IS6110拷贝数和带型.结果:经245bp探针杂交后的指纹图谱显示大部分菌株含9-21个IS6110拷贝,但有1菌株不含IS6110拷贝,另一株含1个IS6110拷贝.结论:结核分枝杆菌上海分离株指纹图谱呈高度多态性.零拷贝菌株和单拷贝菌株不能用IS6110-RFLP DNA指纹分析方法分析.
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PCR法制备地高辛标记DNA探针斑点杂交检测副溶血性弧菌tlh基因
目的 建立检测副溶血性弧菌种特异性tlh基因的斑点杂交方法.方法 采用PCR法制备地高辛标记DNA探针,建立斑点杂交条件.杂交反应条件优化如下:杂交温度65℃,杂交时间9～12 h,探针使用浓度100～125 pg/ml.结果 地高辛标记tlh基因探针长度为450 bp,标记产量为50 μg/ml.探针具有较高的灵敏度和特异性,可重复使用4次.结论 本方法具有快速、简便、高效的特点,适用于副溶血性弧菌菌株的鉴定.
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TaqMan探针法实时荧光定量PCR快速检测沙门菌的探讨
为建立一种快速、灵敏、特异的实时荧光定量PCR法用于沙门菌的检验,根据GenBank上登录的编号为AE016841的沙门菌序列,应用生物学软件在fimY基因的保守区设计引物和TaqMan探针,同时应用BLAST程序进行网上序列比对,并进行筛选、优化.用鼠伤寒标准菌和60份食品样本进行本检测方法的特异性、敏感性和重复性试验,并与常规法和科玛嘉平板分离法做比较.本方法对沙门菌的检测具高度的特异性,检测的灵敏度达102CFU/ml,从增菌至完成检测仅需24h左右,是一种快速检测沙门菌的敏感、特异的新方法.
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支原体临床检测分析
关于支原体检验问题支原体的检查方法很多,有免疫荧光法、间接血凝法、DNA探针法、PCR法、培养法等,国家规定的"金标准"方法是培养法.
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PCR方法制备地高辛标记DNA探针检测中国对虾非包涵体型杆状病毒
对虾白斑症杆状病毒(white spot baculovirus,WSBV)在过去6年内已使包括中国大陆在内的整个亚洲地区对虾养殖业严重滑坡.1992年中国大陆养殖对虾产量为20万吨,居世界首位,自1993年受中国对虾非包涵体型杆状病毒(Panaeus chinensis non-occluded baculovirus,PcNOBV)侵袭暴发虾病以来,年产量仅六、七万吨,造成巨大经济损失.对虾属无脊椎动物,缺乏特异性免疫系统,养殖水体环境的恶化及养殖密度的加大,促进了对虾病毒性流行病的发生和传播.目前有效的防治方法仍然是避免使用带毒亲虾、虾苗及鲜活饵料,尽早发现和消灭传染源.因此,迫切需要建立一种敏感、特异并且适用于基层实验室的检测方法.
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结直肠锯齿状病变中p16基因甲基化状态和蛋白表达的研究
目的 检测锯齿状病变组织中p16基因启动子区异常甲基化改变和p16蛋白的表达情况,探讨其在锯齿状癌变通路中的作用和临床病理意义,同时探讨p16基因在不同年龄层段甲基化程度.方法 采用Taqman探针实时定量PCR (Methylight)方法检测225例锯齿状病变(包括96例HP、61例SSA/P和68例TSA)、54例TA、69例CRC和42例正常结直肠黏膜组织中的p16基因甲基化状态,并通过测序法验证扩增的目的片段;同时应用免疫组化方法检测其中随机抽取的116例锯齿状病变(包括52例HP、41例SSA/P、23例TSA)、20例TA、24例CRC和24例正常结直肠黏膜组织中p16蛋白的表达.结果 p16基因启动子甲基化状态和p16蛋白异常阳性程度在锯齿状病变和对照组中均有显著差异(P＜0.05),两者比较呈负相关(P ＜0.05);p16基因启动子甲基化频率与不同年龄层段的相关性比较有显著差异(P＜0.05),两者呈正相关.结论 结直肠锯齿状病变组织中p16基因甲基化可能是诱导其蛋白表达下调的主要原因,且在结直肠“增生性息肉-锯齿状腺瘤-癌”的锯齿状癌变通路中起重要作用;同时p16基因甲基化又可能与年龄相关,随年龄增长甲基化程度越高.
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产毒型O1群霍乱弧菌特异性基因序列实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立
目的 建立针对O1 群霍乱弧菌的高敏感、高特异的实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应快速检测体系.方法 根据O1 群霍乱弧菌主基因组O 抗原编码基因rfb-O1 和霍乱肠毒素的A 亚基编码基因ctxA 的特异性序列设计引物及TaqMan 探针,利用便携式Smartcycler II实时荧光PCR 检测平台探讨该检测体系的敏感性,用19种其他肠道致病菌及院内感染常见致病菌评价该检测体系的特异性.结果 实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应快速检测体系对O1 群霍乱弧菌的检测敏感度为1.0 × 102 拷贝每反应体系;对O1 群霍乱弧菌基因组DNA 的检测敏感度为1.0 × 10-1 pg 每反应体系;该检测体系在检测19 种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌时不存在非特异性扩增;整个反应在2 h 内完成.结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应检测体系可作为产毒型O1 群霍乱弧菌特异、敏感、快速的检测手段,也可同时检测O1 群霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的能力.
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双探针显色和荧光原位杂交法检测乳腺癌HER2基因状态和17号染色体的分析
目的 通过与荧光原位杂交(FISH)比较,评估双探针显色原位杂交(双探针CISH)法在诊断女性乳腺浸润性导管癌HER2基因状态中应用的可靠性,同时探讨17号染色体多倍体对原位杂交诊断HER2基因状态时可能产生的影响.方法 收集146例乳腺癌组织的常规石蜡包埋标本,分别用欧盟(CE)认证的FISH(146例)及CISH(73例)HER2/17号染色体着丝粒(CENl7)双探针试剂盒技术,对肿瘤标本的HER2基因状态进行检测,并按照2007年美国临床肿瘤协会及美国病理家协会(ASCO/CAP)标准分别用计算HER2基因拷贝数和(或)计算HER2/CENl7比值的方法对结果进行分析.结果 在同时进行FISH和双探针CISH检测的73例标本中发现,两种技术对HER2阴性和阳性的诊断符合率分别为91.7%(33/36)和97.4%(37/38),两者的总体符合率为95.9%(70/73);在对146例FISH结果的计数分析中,计数HER2基因拷贝数得出不确定诊断的病例量是计数HER2/CENl7得出不确定诊断病例量的1.6倍(13/8);此外,在FISH和CISH结果中按拷贝数计数为阳性的病例与在按比值计数时却为阴性病例的不吻合率分别为4.8%(3/63)和3.O%(1/33);同时在FISH HER2阳性病例(HER2/CENl7)中多倍体发生率为63.5%(40/63,P=0.002),高于阴性者中多倍体的发生率(37.3%,28/75).结论 双探针CISH技术检测乳腺癌HER2基因状态的结果和FISH技术检测的结果非常一致,提示两种技术临床诊断价值相近,并且同步检测并计数HER2和17号染色体有助于明确HER2基因状态.
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即时定量PCR-Sanger测序与TaqMan探针法检测结直肠癌KRAS、BRAF基因突变的对比分析
目的 对比分析即时定量PCR-Sanger测序与TaqMan探针法检测KRAS、BRAF基因突变的应用价值；探讨结直肠癌KRAS和BRAF基因突变与临床及病理的相关关系.方法 收集2008至2012年344例结直肠癌标本,经4％中性甲醛液固定、石蜡包埋组织后切片、刮取富集肿瘤细胞后提取DNA,应用即时定量PCR-Sanger测序与TaqMan探针两种方法检测分析KRAS、BRAF基因的突变阳性率、突变类型及其与临床病理特征和生存时间的相关性等.结果 即时定量PCR-Sanger测序与TaqMan探针法检出KRAS基因突变率分别为39.8％ (137/344)和38.7％(133/344),BRAF基因突变阳性率分别为4.7％ (16/344)和4.1％(14/344),两种方法结果差异无统计学意义(P＞0.05).KRAS基因突变阳性率女性高于男性；BRAF基因突变阳性率结肠高于直肠,Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期,印戒细胞癌高于黏液癌,非特殊类型腺癌低,Ⅲ级高于Ⅱ级,差异均有统计学意义(P＜0.05).两种方法总符合率为98.8％(Kappa值0.976).BRAF基因突变型与KRAS基因突变型的患者生存时间差异有统计学意义(P =0.039),BRAF基因突变型与BRAF/KRAS野生型的患者生存时间差异无统计学意义(P=0.058).结论 (1)与Sanger测序法相比,TaqMan探针法具有操作简便、耗时短、效率高、重复性好、费用低以及不需特别仪器设备等优点,具有更高的临床应用价值；(2)结直肠癌中KRAS基因突变率与性别具有相关性,而BRAF基因突变率与原发部位、临床分期、组织学类型及组织学分级具有相关性；(3) BRAF基因突变是结直肠癌患者的独立预后因素.
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新疆地区非小细胞肺癌中表皮生长因子受体基因突变与临床病理特征的关系
目的 探讨新疆地区表皮生长因子受体(EGFR)基因点突变在非小细胞肺癌中与临床病理特征之间的关系.方法 收集2013年1月至2015年12月新疆医科大学第一附属医院病理科检测的582例非小细胞肺癌患者石蜡包埋组织,用Qiagen试剂盒提取DNA,经TaqMan探针荧光定量qRT-PCR技术检测非小细胞肺癌中EGFR基因第18、19、20、21号外显子共32个点突变,分析其突变情况与临床病理特征的相关性.结果 582例非小细胞肺癌患者的石蜡包埋组织中,EGFR基因点突变173例,突变率为29.7%(173/582).患者女性(50.5%、98/194)、无吸烟史(47.3%、96/203)、高分化(6/9)、腺鳞癌(6/11)、周围型(34.9%、88/252)、手术标本(38.2%、83/217)EGFR基因突变率高,差异有统计学意义(P<0.05).Logistic回归多因素分析显示仅有变量性别、分化程度、病理类型对EGFR基因突变有统计学意义(P<0.05),其他变量与EGFR基因突变没有统计学意义.结论 非小细胞肺癌患者EGFR基因突变以女性、不吸烟、高分化腺癌中突变率较高,差异有统计学意义,其中性别、分化程度及病理类型为EGFR基因突变状况的独立影响因素.
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LNA探针同时检测人副流感病毒1,2,3型多重荧光定量RT-PCR方法的建立
目的 人副流感病毒1,2,3型是呼吸道感染的主要病原.本研究建立了特异、快速、灵敏的多重荧光定量RT-PCR方法用于人副流感1,2,3型病毒临床标本检测.方法 针对人副流感1,2,3型病毒设计特异性引物探针,优化荧光RT-PCR反应条件.应用体外转录方法分别制备人副流感1,2,3型病毒的标准品.验证荧光定量RT-PCR方法的特异性,敏感性和稳定性.结果 该方法对人副流感1,2,3型病毒核酸检测有高度特异性,检测的灵敏度HPIV1为10个拷贝,HPIV2为100个拷贝,HPIV3为100个拷贝.可从临床患者鼻咽吸出物标本中直接检出.结论 本研究建立的LNA探针同时检测人副流感病毒1,2,3型多重荧光定量RT-PCR方法具有较高的特异性和敏感性.适用于临床早期诊断和实验室病原谱筛查.
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采用TaqMan MGB探针定量检测HCV 1b基因型C区氨基酸70变异
目的 建立一种定量检测HCV 1b基因型C区氨基酸70位点主要野生株(Arg-CGG,70w)和变异株(GIn-CAG,70M)的方法.方法 设计一对分别针对70 W和70 M的TaqMan MGB探针,建立一种实时逆转录聚合酶链反应定量检测方法.验证方法的敏感性、特异性和准确性.结果 所设计的引物和探针具有良好的特异性,敏感性可达5拷贝/反应.进一步的克隆测序证实了新方法的可靠性.结论 建立了一套HCV 1b亚型C区氨基酸70变异的定量检测系统,具有较高的敏感性、特异性和准确性,为研究70 W和70 M在抗病毒治疗中的动态变化提供了技术手段.
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DNA探针杂交技术与涂片镜检法检测结核杆菌对比分析
目的:评价DNA探针杂交技术检测TB的临床应用价值.方法:应用DNA探针杂交法和涂片镜检法检测330份痰液标本.结果:检测治疗前、后结核病患者标本,DNA探针杂交法阳性检出率分别为56.7%、24.2%,明显高于涂片法检出率(P<0.01);两种方法检测90份非结核病患者痰液标本符合率均为100%.结论:DNA探针杂交技术适用于结核病诊断、药物疗效判断等方面.
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用随机扩增DNA多态性制备李斯特菌属特异探针
目的研究一种在微生物遗传背景不清楚情况下,快速制备探针的新方法.方法采用随机扩增DNA多态性技术随机扩增李斯特菌基因组,将其中的单核细胞增生李斯特菌扩增产物克隆制备DNA探针, 探针用聚合酶链反应标记上32P,与李斯特菌和非李斯特菌进行菌落原位杂交鉴定其特异性.结果获得一长度为850 bp,能与所有李斯特菌特异杂交而不与非李斯特菌反应的李斯特菌属特异探针.结论随机扩增DNA多态性技术为快速制备微生物DNA探针提供了一种新途径.
