产毒型O1群霍乱弧菌特异性基因序列实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立
摘要： 目的 建立针对O1 群霍乱弧菌的高敏感、高特异的实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应快速检测体系.方法 根据O1 群霍乱弧菌主基因组O 抗原编码基因rfb-O1 和霍乱肠毒素的A 亚基编码基因ctxA 的特异性序列设计引物及TaqMan 探针,利用便携式Smartcycler II实时荧光PCR 检测平台探讨该检测体系的敏感性,用19种其他肠道致病菌及院内感染常见致病菌评价该检测体系的特异性.结果 实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应快速检测体系对O1 群霍乱弧菌的检测敏感度为1.0 × 102 拷贝每反应体系;对O1 群霍乱弧菌基因组DNA 的检测敏感度为1.0 × 10-1 pg 每反应体系;该检测体系在检测19 种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌时不存在非特异性扩增;整个反应在2 h 内完成.结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应检测体系可作为产毒型O1 群霍乱弧菌特异、敏感、快速的检测手段,也可同时检测O1 群霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的能力.
-
人工耳蜗植入者线粒体12S rRNA基因突变的分析
目的 研究接受人工耳蜗植入的耳聋患者中,线粒体12SrRNA基因突变的类型和发生概率.方法 选取100例接受人工耳蜗植入的非综合征性耳聋患者(语前聋96例,语后聋4例;氨基糖苷类药物使用史者16例),取外周血提取基因组DNA,以PCR方法扩增线粒体12S rRNA基因,扩增产物纯化后直接测序分析突变.结果 100例患者中有2例检测到线粒体12S rRNA基因1555AG纯合突变,1例检测到delT961Cn杂合突变,致病基因突变总检出率为3%.结论 在所研究的人工耳蜗植入群体中,线粒体12S rRNA基因突变不是主要的致聋病因.
-
产毒型O1群霍乱弧菌特异性基因序列实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立
目的 建立针对O1 群霍乱弧菌的高敏感、高特异的实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应快速检测体系.方法 根据O1 群霍乱弧菌主基因组O 抗原编码基因rfb-O1 和霍乱肠毒素的A 亚基编码基因ctxA 的特异性序列设计引物及TaqMan 探针,利用便携式Smartcycler II实时荧光PCR 检测平台探讨该检测体系的敏感性,用19种其他肠道致病菌及院内感染常见致病菌评价该检测体系的特异性.结果 实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应快速检测体系对O1 群霍乱弧菌的检测敏感度为1.0 × 102 拷贝每反应体系;对O1 群霍乱弧菌基因组DNA 的检测敏感度为1.0 × 10-1 pg 每反应体系;该检测体系在检测19 种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌时不存在非特异性扩增;整个反应在2 h 内完成.结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应检测体系可作为产毒型O1 群霍乱弧菌特异、敏感、快速的检测手段,也可同时检测O1 群霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的能力.
-
重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白的药效学、药理学和毒理学研究
目的 对重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白(rHSA/GCSF)开展药效学、药理学和毒理学动物评价研究,以确认其安全性和有效性.方法 ①对 rHSA/GCSF 开展的药效学研究内容主要有:以恒河猴骨髓细胞为研究系统,在体外条件下培养骨髓粒细胞-巨噬细胞集落(CFU-GM),计数不同浓度的 rHSA/GCSF对 CFU-GM 数的影响的体外药效学评价;以小鼠 60Coγ照射、氟尿嘧啶注射液所致的鼠白细胞低下和对 60Coγ射线照射致食蟹猴白细胞低下的治疗作用.②药理学研究观察了 rHSA/GCSF 对小鼠中枢神经系统和狗呼吸及心血管系统功能的影响.③毒理学研究考察了 rHSA/GCSF 静脉和皮下给予小鼠、食蟹猴的急性毒性反应,以及长期和反复给药对大鼠和食蟹猴的安全性做出评价.④ rHSA/GCSF 的药代/毒代试验则是对 125I-rHSA/GCSF 不同剂量单次皮下注射给予小鼠、大鼠后,rHSA/GCSF 在各器官的分布、总放射性和 TCA 沉淀放射性的动力学参数测定,以及对不同剂量 rHSA/GCSF 连续给药食蟹猴后的血浆药物浓度及代谢动力学参数开展了考察.结果 ① rHSA/GCSF 可以使骨髓的粒白细胞系(粒系)增生活跃,骨髓粒系造血细胞及成熟中性粒细胞均明显增多;对氟尿嘧啶所致小鼠白细胞减少症有明显的治疗作用,在使用化疗药早期,可以减缓白细胞的降低,特别是可以使粒白细胞提前恢复到正常水平;rHSA/GCSF 可显著缩短食蟹猴白细胞减少症放疗模型产生的白细胞低下持续时间,使外周血白细胞加速恢复,尤其以中性粒细胞的增加为主,同时对红细胞和血小板的影响不大.②从获得的 PD/PK 数据t1/2 来看:rHSA/GCSF 半衰期平均值约为 38.6 h;单次皮下注射 rHSA/GCSF,在 500、1500、3000 μg/kg 剂量范围内对小鼠中枢神经系统无影响,与戊巴比妥钠无协同作用;单次皮下注射 rHSA/GCSF 在 50、200 μg/kg 剂量范围内对狗呼吸和心血管系统无明显影响.实验表明 rHSA/GCSF单次皮下和静脉注射给予小鼠的大耐受量(MTD)≥37.5 mg/kg,单次皮下注射给予食蟹猴的大耐受剂量为 11.6 mg/kg;长期反复给药对大鼠的基本安全剂量为300 μg/kg,对食蟹猴则是≥ 150 μg/kg.结论 rHSA/GCSF 融合蛋白每 4 天给药 1 次,对放、化疗所致的动物外周血白细胞减少症具有治疗作用,与市售常规 rhGCSF 每天注射 1 次相比具有长效作用.所获得的大量药效学、药代动力学、毒理学、毒代动力学的试验数据可供正在开展的临床试验研究参考,并具有很好的指导意义.
-
3',4',5,7-四（二乙基磷酰基）-木犀草素对碱性脂肪酶活性影响机制的研究
目的探讨黄酮类化合物3',4',5,7-四(二乙基磷酰基)-木犀草素对碱性脂肪酶活性的影响。
方法采用3',4',5,7-四(二乙基磷酰基)-木犀草素作为抑制剂，以改进后的铜皂法测定脂肪酶活性，测定3',4',5,7-四(二乙基磷酰基)-木犀草素的浓度与脂肪酶活性的关系，得出该化合物对脂肪酶活性影响，并测定其 IC50值。
结果该化合物对碱性脂肪酶活性的抑制作用为非竞争性抑制，其 IC50为3.17×10-7 mol/L。米氏常数 Km=100 mmol/L，抑制常数 Ki=2.7×10-7 mol/L。
结论3',4',5,7-四(二乙基磷酰基)-木犀草素对碱性脂肪酶的抑制机制是其与酶的活性部位以外的基团作用而导致酶活性降低，呈非竞争性抑制。 -
烷基化低分子量聚乙烯亚胺作为基因递送载体的初步研究
目的考察烷基化低分子量聚乙烯亚胺作为基因递送载体的安全性和有效性。
方法以1-溴十二烷和分子量为1800的分枝状 PEI （bPEI1.8K）为原料，合成 bPEI1.8K-C12，并用1H-NMR 对其结构进行确认；采用 MTT 法考察 bPEI1.8K-C12的细胞毒性；红细胞溶血实验考察 bPEI1.8K-C12的生物相容性；测定bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的粒径分布和 zeta 电位；采用激光共聚焦显微镜观察 bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的细胞摄取行为；采用琼脂糖凝胶阻滞电泳考察 bPEI1.8K-C12对DNA 的固缩能力；并用荧光素酶报告基因和绿色荧光蛋白报告基因考察 bPEI1.8K-C12的体外转染效率。
结果经1H-NMR 确认，成功合成了 bPEI1.8K-C12；MTT结果表明 bPEI1.8K-C12对人乳腺癌 MCF-7细胞的毒性与bPEI1.8K 相当；红细胞溶血实验结果表明高浓度 bPEI1.8K-C12静脉注射时具有潜在溶血性；质量比相同时，bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的平均粒径和 zeta 电位均比相应的bPEI1.8K/DNA 大；烷基化修饰后，bPEI1.8K-C12对 DNA 的固缩能力降低，MCF-7细胞对 bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的摄取效率大大增加，bPEI1.8K-C12递送报告基因质粒的体外转染效率显著高于 bPEI1.8K，甚至与 lipofectamine2000相当。
结论 bPEI1.8K-C12是一种安全高效的基因递送载体，具有较高的进一步开发前景。 -
香菇多糖树脂法脱蛋白质工艺研究
目的 用树脂去除香菇多糖粗品中的蛋白质,纯化香菇多糖.方法 以香菇多糖得率和蛋白质去除率为指标,比较5种不同种类树脂(D303、D315、HZ816、HZ801、FPA98)对香菇多糖粗品吸附的情况,并通过单因子试验与正交试验优化树脂去除香菇多糖中蛋白质的工艺参数.结果 强碱性阴离子树脂FPA98吸附效果好,在pH值为9.0,上样质量浓度为2 mg/ml,上样量为每毫升树脂20 mg,流速为1 BV/h的工艺条件下,香菇多糖提取液中的蛋白质去除率可达70％以上,多糖保留率为80％以上.结论 此工艺操作简单,环保,具有较好的实用性.
-
电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物/Ⅰ型胶原-聚己内酯双层膜预防腱周粘连的相关研究
目的 探讨聚乳酸-羟基乙酸共聚物/Ⅰ 型胶原-聚己内酯双层膜的结构、成分、亲水性、组织相容性和细胞毒性,以及该膜对鼠L929成纤维细胞黏附和活性的影响,从而明确该电纺膜在预防肌腱断裂后腱周粘连的可行性.方法 制备单纯电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物膜和电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物/Ⅰ 型胶原-聚己内酯双层膜.通过扫描电镜、红外光谱、接触角检测分析电纺膜的超微结构、成分以及亲水性能;通过溶血试验、热原试验、致敏试验和MTT法验证电纺膜的组织相容性和细胞毒性;将鼠L929细胞种植在单纯电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物膜和电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物/Ⅰ型胶原-聚己内酯双层膜上,体外培养4 d后进行死/活细胞染色,通过共聚焦显微镜观察比较L929细胞在两组膜上的黏附和活性情况.结果 两种电纺膜由纳米级-微米级的纤维丝有序排列,形成致密多孔的网状结构.且溶血试验、热原试验、致敏试验结果均呈阴性.MTT检测发现,L929细胞在电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物/Ⅰ型胶原-聚己内酯双层膜的DMEM浸提液组和正常培养液组中的OD570值的差异没有统计学意义(P>0.05);死/活细胞染色提示,鼠L929成纤维细胞在电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物/Ⅰ 型胶原-聚己内酯双层膜的 Ⅰ型胶原-聚己内酯层上第4天的黏附率和生存率显著高于对照组(P<0.05),而L929细胞在单纯电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物膜上的黏附率和生存率显著低于对照组(P<0.05).结论 电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物/Ⅰ 型胶原-聚己内酯双层膜是由纳米级-微米级有序排列的纤维丝构成的多孔膜片,而且组织相容性良好,无明显细胞毒性.其聚乳酸-羟基乙酸共聚物层可以有效抑制成纤维细胞的黏附和生存,Ⅰ型胶原-聚己内酯层可以促进细胞的黏附和存活.电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物/Ⅰ 型胶原-聚己内酯双层膜对预防肌腱断裂后腱周粘连具有潜在的临床应用价值.
-
檀香形成部位内生真菌多样性研究
目的旨在考查檀香形成部位内生真菌的定植情况，并探讨檀香结香部位木材和正常生长的健康木材之间内生真菌的差异，揭示真菌诱导檀香结香的原因。
方法采用组织块分离法对檀香结香部位木材和正常生长的健康木材进行内生真菌的分离培养和统计分析，并采用形态学和分子生物学两种方法对分离得到的真菌进行鉴定。
结果檀香结香部位木材内生真菌定植率较高（92.5%），而正常木材内生真菌定植率较低（27.5%）。分离率也是檀香结香部位木材较高（0.9），健康正常木材较低（0.25）。檀香正常生长的健康白木材分离的内生真菌只有2种；结香部位木材分离得到13种，隶属于4个属，分别为拟茎点霉属、镰孢属、曲霉属和 Phaeoacremonium。在檀香结香部位分离的内生真菌中，优势菌属是镰孢属和拟茎点霉属；在檀香健康木材分离的优势菌属是拟茎点霉属。
结论檀香结香部位木材内生真菌表现出了较高的种属多样性。檀香局部结香可能是由外界损伤和真菌的侵染诱导而形成的。 -
树突状细胞诱导的CIK细胞对肺癌生长的抑制作用
目的 探讨树突状细胞诱导的 CIK 细胞对肺癌移植瘤细胞生长的抑制作用.方法 建立肺癌皮下移植瘤模型;分离患者外周血单个核细胞,培养成熟的 DC 及 CIK 细胞;用反复冻融肺癌组织的方法 制备肿瘤细胞裂解物并负载 DC,诱导 DC-CIK 细胞;进行肺癌移植瘤内注射,比较两组裸鼠移植瘤体积及重量,观察其抑瘤情况.结果 DC-CIK 细胞对肺癌皮下移植瘤细胞的抑制率为70.3%,抑制作用明显强于 DC 或 CIK 细胞的抑制作用(P < 0.05).结论 树突状细胞诱导的 CIK 细胞能够有效抑制肺癌移植瘤生长.
-
HPLC法定量测定酵母发酵上清液中重组新蛭素的含量
目的 建立HPLC技术定量测定发酵上清液中重组新蛭素(EH)含量的方法,用于监测发酵过程中EH的表达量变化与诱导时间的关系,使EH产量大化.方法 利用HPLC技术建立EH的检测方法,通过对该方法的灵敏度、精密度和加标回收率实验的考察,确立该方法的可行性;利用该方法对EH样品进行稳定性考察,并对酵母发酵上清液进行跟踪检测.实现了对发酵过程中发酵上清液中EH的实时监测.结果 EH在214nm处有较强的特异性吸收峰,其吸收峰面积与含量存在很好的线性关系,r2=0.9995,EH线性浓度范围在0.012 ～ 4.8 mg/ml.该测定方法具有很好的精密度,样品多次重复测定的RSD值为1.4227％;加标回收率在95％ ～ 98％.应用该方法对EH样品的稳定性测定结果显示,样品4℃保存稳定性较好,24 h内样品主峰面积百分比＞95％,在20℃条件下,8h内样品稳定性良好,主峰面积百分比＞95％.该方法准确度高、重复性好,进行测定时,可根据EH的特异吸收峰,对发酵过程中发酵上清液中EH含量进行实时定量测定.测定结果显示,在一定时间范围内,EH的表达量与诱导时间成正相关.结论 本研究建立了HPLC技术检测EH含量的方法,该方法可用于发酵过程中EH的实时定量监测,使EH的产量达到大值,为EH的临床样品制备提供有力支持.
