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水产品中致病性弧菌污染状况研究
目的 了解水产品中致病性孤菌污染状况.方法 采用实时荧光PCR方法对样品中的致病性弧菌进行初筛.阳性样品用传统培养法确证.结果 检测了海产品、淡水水产品共12类1356份样品,未检出致病性的O1群霍乱弧菌,但有非O1群霍乱弧菌存在;海产品的虾类、蟹类、贝类、软体类带副溶血性弧菌率高.结论 珠海地区水产品中弧菌污染较为普遍,且存在着多重污染现象.
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O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表定殖模式的建立及与O139血清群霍乱弧菌定殖能力比较
目的 分析O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表的定殖能力,并比较O1与O139血清群霍乱弧菌菌株在甲鱼体表定殖能力的差异.方法 所用O1及O139血清群霍乱弧菌均为中国疾病预防控制中心传染病预防控制所腹泻病室保存,各4株.实验用甲鱼选择背甲直径约9 cm、体重约150 g的甲鱼,共63只.利用小动物活体成像直接观察生物发光标记的O1血清群霍乱弧菌菌株在甲鱼体表的定居部位及增殖;构建O1血清群霍乱弧菌主要定居因子的基因缺失株(mshA,gbpA,tcpA基因),通过竞争定殖实验计算竞争定殖系数(CI),分析O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表定殖的主要决定因子;对O1及O139血清群霍乱弧菌两两配对,组成16个竞争组,通过竞争定殖实验比较两种血清群霍乱弧菌在甲鱼体表定殖能力的差异.结果 O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表的定殖具有位置聚集性,以甲鱼背部裙边和背甲定殖强,腹甲定殖很少.竞争定殖实验显示,mshA基因缺失后,O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表的定殖能力下降了7.26倍.16个竞争组中有11组的CI值(O139/O1)大于2,在2.07~59.84之间;有2组分别为1.43及0.93;有3组的CI值低于0.7.结论 确定了霍乱弧菌在甲鱼体表的定殖部位;mshA基因为O1血清群霍乱弧菌在甲鱼体表定殖时发挥作用的主要定居因子;O139血清群菌株比O1血清群菌株有更强的定殖优势,且直接分离自甲鱼的菌株定殖能力更强.
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1961-2010年中国O1群El Tor型霍乱弧菌产毒株ctxB和rstR基因变迁
目的 分析1961-2010年中国不同地区分离的O1群El Tor型霍乱弧菌产毒株的ctxB变异特征和rstR基因类型.方法 选取中国1961-2010年间分离的O1群霍乱弧菌菌株作为研究对象,共385株.应用PCR方法扩增ctxB基因并进行序列测定和分析;使用rstR型特异性引物扩增rstR基因,确定其基因型别.结果 ctxB基因序列分析表明,385株被检菌株中52.5％(202/385)携带ctxBET,47.5％(183/385)携带ctxBc1ass,即第39位的酪氨酸(Y)变为组氨酸(H),68位的异亮氨酸(Ⅰ)变为苏氨酸(T),呈现古典生物型菌株(O395)的序列特征.1961-1992年以携带ctxBET的菌株占绝对优势,比例高达98.4％(182/185);1993年后,携带ctxBclass的菌株增加,其中1993-2005年间携带ctxBc1ass菌株的比例达到97.2％ (174/179);自2006年开始,重新出现了ctxBET为主导或二者共存的局面.rstR基因的检测表明约62.9％(242/385)的菌株携带rstRET,6.8％ (26/385)的菌株携带rstRclass,其余菌株中存在不同的rstR组合形式,其中,以rstRET+ rstRc1as的组合多,占75.7％(75/99).与ctxB相似,不同型别rstR的分布呈现时间特异性,1961-1992年期间以携带rstRET的菌株占主导(87％,161/185),1993年以后出现多态性变异,携带其他类型rstR如rstRclass,rstRenv及不同rstR组合的菌株明显增多,与rstRET共同存在.96％(25/26)、84％(63/75)和18/18的分别携带rstRclass、rstRET+ rstRclass组合和rstRET+ rstRc1ass+ rstRenv组合的菌株均分离于1993年之后.结论 中国霍乱弧菌菌株中ctxB和rstR的型别分布有明显的时间特异性,rstR存在多种组合形式,反映了菌株多样性的遗传和进化特征.
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产毒型O1群霍乱弧菌特异性基因序列实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立
目的 建立针对O1 群霍乱弧菌的高敏感、高特异的实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应快速检测体系.方法 根据O1 群霍乱弧菌主基因组O 抗原编码基因rfb-O1 和霍乱肠毒素的A 亚基编码基因ctxA 的特异性序列设计引物及TaqMan 探针,利用便携式Smartcycler II实时荧光PCR 检测平台探讨该检测体系的敏感性,用19种其他肠道致病菌及院内感染常见致病菌评价该检测体系的特异性.结果 实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应快速检测体系对O1 群霍乱弧菌的检测敏感度为1.0 × 102 拷贝每反应体系;对O1 群霍乱弧菌基因组DNA 的检测敏感度为1.0 × 10-1 pg 每反应体系;该检测体系在检测19 种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌时不存在非特异性扩增;整个反应在2 h 内完成.结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应检测体系可作为产毒型O1 群霍乱弧菌特异、敏感、快速的检测手段,也可同时检测O1 群霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的能力.
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产毒型O1群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan PCR的临床应用前研究
目的 探讨产毒型O1 群霍乱弧菌实时荧光双重TaqManPCR 法对临床模拟标本检测的意义,为该法的临床应用提供可靠的技术依据.方法 将O1 群霍乱弧菌灭活菌株悬液[1.0 × 1011 CFU(菌落形成单位)/ml]连续10 倍稀释后与健康成人新鲜粪便混匀,制备成5.0 × 101～5.0 × 109 CFU/g 梯度浓度的模拟带菌者粪便标本并提取DNA,用以评价产毒型O1 群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan PCR 法对临床模拟标本检测的灵敏度、特异性和稳定性.结果 实时荧光双重TaqMan PCR 法对O1 群霍乱弧菌的模拟带菌者粪便标本的检测灵敏度为1.0 × 103 CFU(5.0 × 104 CFU/g)每反应体系,其检测线性范围为1.0 ×103～1.0 × 108 CFU 每反应体系;在稳定性评价中,对含菌量1.0 × 103～1.0 × 108 CFU 每反应体系模拟带菌者粪便标本DNA 进行3 次重复检测的结果 显示,ctxA 基因扩增反应Ct 值的变异系数为0.54%～1.36%,rfb-O1 基因扩增反应Ct 值的变异系数为1.65%～3.75%;在特异性评价中,3 名健康成人新鲜粪便标本的阴性对照均未见特异性扩增曲线.结论产毒型O1 群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan PCR法可用于O1 群霍乱弧菌临床粪便标本的检测.
