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神经源性痛诱发大鼠背根神经节细胞电生理学变化
动作电位的异常爆发和编码是痛觉信号传递的电生理学基础.越来越多的证据表明,外周感觉神经元的敏化是慢性痛发生的重要机制之一.本次实验通过结扎大鼠单侧L5和L6脊神经诱发神经源性痛,经Von Frey Hair机械痛敏测量法筛选后,运用全细胞膜片电流钳技术研究急性分离的背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)细胞电生理学特征,结果发现:①对照组大鼠背根神经节小直径神经元(细胞直径<30μm)的动作电位阈值为-11.12±1.06 mV(n=11),神经源性痛后小直径神经元动作电位阈值降低了7.82 mV(-18.98±0.69,n=9),二者有显著性差异(P<0.01);与对照组相比,神经源性痛后中等直径DRG神经元(30 μm≤细胞直径≤40μm)兴奋性升高,其动作电位爆发阈从-14.55±1.81 mV(n=8)降低至-19.44±2.22 mV(n=9),差异显著(P<0.05).
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2.130不饱和脂肪酸对豚鼠胃窦平滑肌细胞钙激活钾电流的影响
目的不饱和脂肪酸对豚鼠胃窦平滑肌细胞钙激活钾电流的影响.方法本实验在急性分离的豚鼠胃窦平滑肌上,利用膜片钳技术的全细胞记录法观察了外源性不饱和脂肪酸对豚鼠胃窦平滑肌细胞钙激活钾电流(IK(Ca))的影响,及其作用机制.
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分离大鼠大脑皮质神经元长时程单细胞内Ca2+的测定
采用酶解结合机械分离方法,急性分离生后6~7 d的SD大鼠的大脑皮质神经元;用Fura -2作为钙离子指示剂,用M40 钙离子测量系统(PTI)长时程测量单个细胞内钙离子浓度的变化.以激发光波长340 nm和380 nm时510 nm处的荧光发射强度比率(340/380)显示胞内C a2+ 浓度的动态变化.用高K+ (60 mmoL/L)、低K+(1 mmol/L)、氨甲酰胆碱(Carbachol, 108~107 mmol/L)作为刺激物,观察胞内Ca2+浓度的变化.结果发现,高K+ 引起去极化刺激,导致Ca2+浓度迅速增加,在去除刺激后自动恢复正常;低K+和 Carbachol能诱发自发钙震荡;且63个细胞中37个有自发Ca2+浓度震荡现象,震荡的频率和幅度不尽相同.结果提示,急性分离的单个神经元可用于Ca2+浓度测定,神经元在无突触联系存在的情况下可诱发或自发钙震荡.
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急性分离大鼠皮层神经元的方法与体会
目的:建立急性分离大鼠皮层神经元的方法.方法:切取活脑组织切片,经Protease酶解消化、孵育后,采用酶加机械分离法制备10-16 d鼠龄的大鼠皮层神经元.作形态学观察,用全细胞膜片钳技术记录其电生理学特性.结果:分离出的神经元倒置相差显微镜下形态保持良好,有较长的轴突;用膜片钳技术证实,80%以上细胞可以记录出电活动,其保存了主要的离子通道活性.结论:成功建立了一种经济、简便的适用于膜片钳技术的大鼠皮层神经元急性分离方法.
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大鼠大脑皮层神经元上的延迟整流型钾离子单通道
延迟整流型钾通道在动作电位的复极化和时程控制以及绝对不应期的形成中充当重要角色.本文用细胞贴附式和内面向外式膜片箝技术研究了急性分离的SD大鼠大脑皮层神经元上延迟整流型钾通道的特性和阻断剂对其的作用,对推动钾通道的研究,了解皮层神经元电活动的规律有重要意义.
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急性分离缰核神经细胞膜上外向整流钾通道的电生理特性
钾电流参与静息电位的形成及动作电位的复极过程,许多神经递质通过调节K+通道的活动而影响细胞膜的兴奋性。缰核(Hb)是连接边缘前脑至脑干背侧通路的驿站,参与机体活动的调节。Hb内也存在多种神经递质,而这些递质对K+通道活动的影响知之甚少。且关于Hb神经细胞膜上K+通道的研究主要运用分子生物学的方法,电生理研究较少。本实验用膜片钳的方法探讨了Hb神经细胞膜上常见的一种K+通道的电生理特性,为探讨Hb内神经递质的作用机制提供基础。
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一种适合膜片钳单通道记录的大鼠DRG神经元急性分离方法
目的:建立一种适合膜片钳单通道记录的脊髓背根神经节神经元急性分离方法.方法:用酶消化和机械分离相结合的方法急性分离大鼠DRG神经元.结果:用本方法分离的DRG细胞容易形成较高的封接电阻(>5GΩ),降低了噪音干扰,可记录到pA级的单通道电流.结论:本方法急性分离的DRG神经元适合单通道膜片钳实验研究.
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自发性癫(疒间)大鼠海马CA3区神经元电压门控钙通道功能异常
自发性癫(疒间)大鼠(SER;zi/zi,tm/tm)是通过异型合子大鼠交配得到的一种双重突变型大鼠,8周龄以上的SER可自发表现出强直性惊厥,并在皮层与海马脑电图(EEG)中伴随有5~7 Hz棘波(疒间)样放电.SER是研究新型抗癫(疒间)药物长短期药效的一种非常有用的动物模型.在单刺激苔状纤维反复触发的条件下,SER海马CA3区神经元表现为长时程的去极化漂移.这可能是由于L型钙通道活动增加而引起钙内流增大形成的结果.现有的许多研究表明钙通道在诱发癫(疒间)发作中发挥关键作用,钙通道功能异常参与到了SER癫(疒间)发作的过程中.本实验利用全细胞膜片钳记录模式对急性分离的SER海马CA3区神经元进行研究,探讨神经元的异常兴奋活动是否由电压门控钙通道(VDCCs)而引起.
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异丙酚、咪达唑仑复合对交感神经元钠通道电流的影响
异丙酚与咪达唑仑联合应用可达到增加麻醉效能,减轻循环抑制的目的[1].既往的研究表明,交感神经节钠通道可能参与介导异丙酚的循环抑制作用[2].本文旨在研究异丙酚、咪达唑仑对交感神经节细胞钠通道电流的联合作用,探讨复合诱导循环稳定的可能机制.材料与方法大鼠颈上交感神经节细胞急性分离的方法及全细胞膜片钳记录技术同前[2].在Vh-80mV、Vt 0mV条件下,记录不同浓度的异丙酚、咪达唑仑及其复合在给药前、给药30s后的钠通道电流.
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泮库溴铵对大鼠颈上交感神经元全细胞N型钙通道电流的影响
泮库溴铵具有短暂交感神经兴奋作用[1],但是其作用的确切部位和机制目前仍不明了.本文拟通过观察泮库溴铵对急性分离的大鼠颈上交感神经元N型钙离子通道电流的影响,探讨交感神经元在泮库溴铵交感神经兴奋机制中的作用.
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大鼠心肌细胞急性分离方法及影响因素探讨
目的 探讨酶解法急性分离大鼠心肌细胞的相关影响因素.方法 采用改良Langendorff主动脉逆行灌流法对大鼠全心工作细胞进行酶解分离,分析分离过程中的诸多条件,从中优化佳的分离方案,为膜片钳实验提供合格细胞.结果 分离所用灌流液pH值为7.35~7.40,分离细胞的存活率高.不同复钙方法对后续细胞存活有明显影响.三步梯度复钙后的细胞存活率明显高于一步、二步复钙法.细胞分离时,灌流速度对细胞存活率有较大影响,3 mL/min流速时细胞存活率高,不同灌流流程对分离细胞的质和量较大影响.采用钙-无钙台氏液先后灌流后再行酶解分离方式可获得长杆状、棱角分明、立体感强的心肌细胞,该细胞复钙后存活率为(56.8±2.6)%;直接使用无钙台氏液灌流后再行酶解分离方法获得(572±3.3)%的心肌细胞,其复钙后存活率为(36.7±3.5)%,前述方法明显优于后者.结论 灌流液的pH值、灌流速度、细胞分离后的复钙方法及不同的灌流流程等因素可对大鼠心肌细胞的急性分离结果产生显著影响.
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大鼠海马CAⅠ区锥体细胞的急性分离及全细胞记录方法
目的 寻求一种适用于膜片钳技术(PCT)的大鼠海马CAⅠ区锥体细胞的急性分离及全细胞记录方法.方法 采用酶加机械分离的方法制备10~16 d鼠龄的海马CAⅠ区锥体神经元.其电生理学特性测定用全细胞PCT.结果 所分离的85%神经元不仅形态学特征保存完好,而且保存了主要的离子通道活性.结论 成功建立了一种简单、快速、可靠的适用于PCT的大鼠皮层神经元急性分离方法.
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淀粉样β-蛋白31-35片段对急性分离的海马神经元延时整流钾通道的影响
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大鼠海马锥体神经元的急性分离方法
目的:建立一种适用于膜片钳技术的大鼠海马锥体神经元急性分离方法,并对其离子通道进行描述.方法:采用酶加机械分离法制备10~12 d鼠龄的大鼠海马锥体神经元,用全细胞膜片钳技术测定其生理学特性.结果:分离出的神经元形态正常,有较长突起;用膜片钳技术证实,其保存了主要的离子通道活性.结论:建立一种简单快速的适用于膜片钳技术的大鼠海马锥体神经元急性分离方法.
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以膜片钳技术急性分离新生大鼠尾核神经元
背景:许多离子通道研究需要单个分散的神经元.人工原代培养的神经细胞受环境的影响,自身特性改变较大,而急性分离的神经元却能相对保持完好的生理特性.目的:建立急性分离尾核神经元的方法,用膜片钳技术研究尾核神经元离子通道及其信号转到机制,利于深入了解尾核的功能.设计、时间及地点:以细胞为对象的观察实验,于2008-02/12在三峡大学医学院实验中心完成.材料:新生7-10 d Wistar乳鼠12只,雌雄不限.方法:取7~10 d的大鼠,采用酶和机械分离法制备分散的单个尾核神经元,利用全细胞膜片钳技术记录电压依赖性钙电流.主要观察指标:用全细胞膜片钳急性分离大鼠尾核神经元的形态学视察和电生理特性.结果:用链蛋白酶(Protease)消化及机械分离法,急性分离的新生大鼠尾核神经元,表面光洁,胞膜完整,有较长的突起,形态和生理特性良好.利用急性分离的新生大鼠尾核神经元观察L-钙离子通道电流,所记录的电学参数在正常生理范围内,较好地保存电压依赖性钙离子通道活性.结论:分离出的神经元形态正常,有较长的轴突;保存了主要的离子通道活性,成功建立了一种适用于膜片钳技术的大鼠尾核神经元急性分离方法.
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急性分离Meynert核团神经元方法及其应用
目的建立急性分离Meynert核团神经元方法.方法切取活脑组织切片,经Protease酶解消化、孵育后,机械分离Meynert核团神经元.作形态学观察,通过单细胞膜片钳技术记录电活动.结果分离出的Meynert核团神经元,倒置相差显微镜下形态保持良好,突起较完整.90%以上细胞可以记录出电活动.结论本方法可以获取活的Meynert核团单个神经元,用于单细胞膜片钳、激光共聚焦、流式细胞术等研究.
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一种改良的逼尿肌急性分离方法及离子通道电流检测
目的:建立一种稳定的适合膜片钳技术的逼尿肌细胞急性酶分离方法,为排尿相关障碍性疾病的研究提供必要的技术平台.方法:采用H型胶原酶和木瓜蛋白酶相混合的鸡尾酒酶液对新鲜离体的大鼠膀胱逼尿肌条在37℃条件下振荡消化,α-actin免疫荧光染色对分离并培养的原代细胞进行鉴定,在膜片钳工作台上分别对其进行L型钙电流和BKca钾电流的全细胞记录.结果:可获得大量的单个逼尿肌细胞.经过免疫荧光染色证实为平滑肌细胞.分离细胞活性良好,在膜片钳实验系统上可记录到多种通道电流.结论:建立了一种操作简单、成功率高、活性好的逼尿肌细胞急性酶分离方法并成功应用于膜片钳技术.
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大鼠皮层神经元急性分离改良方法
目的建立一种适用于膜片钳技术的大鼠皮层神经元急性分离改良方法,并对其离子通道电流进行记录.方法采用酶加机械分离法制备12~16d鼠龄的大鼠皮层神经元.其电生理学特性测定用全细胞膜片钳技术.结果分离出的神经元形态正常,有较长的轴突;用膜片钳技术证实,其保存了主要的离子通道活性.结论成功建立了一种简单快速的适用于膜片钳技术的大鼠皮层神经元急性分离改良方法.
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大鼠背根节慢性压迫或急性分离引起的cGMP-PKG信号通路持续激活介导背根节神经元的异常兴奋性和痛觉过敏
背根节(dorsal root ganglion,DRG)损伤或炎症可导致DRG神经元兴奋性异常增强和痛觉过敏.我们近期研究显示,长期慢性在体压迫(chronic compression of DRG,CCD)或急性离体分离(acute dissociation of DRG,ADD)背根节导致的神经元兴奋性异常增强和痛觉过敏受环鸟苷酸(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信号通路活动的调控.本研究采用大鼠CCD模型和ADD模型,直接在DRG上检测cGMP浓度和PKG mRNA及其蛋白质的表达,进一步证明了cGMP-PKG信号通路活动在CCD和ADDDRG所致神经元兴奋性异常增强和痛觉过敏中的重要作用.酶联免疫吸附测定(ELISA)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的实验结果显示,CCD或ADD明显增高DRG内的cGMP浓度,上调Ⅰ型PKG mRNA和PKG蛋白质表达.电生理膜片钳全细胞记录结果显示,CCD和ADD显著增强伤害特异性DRG细胞的兴奋性及其对cGMP-PKG信号通路激动剂的反应强度.增强的细胞兴奋性可以被cGMP-PKG通路阻断剂所抑制.在体压迫DRG的椎间孔内注射cGMP-PKG抑制剂显著减轻痛觉过敏.以上研究结果表明,CCD和ADD可以激活DRG细胞内的cGMP-PKG信号通路,而损伤的DRG细胞的超兴奋性和痛觉过敏的维持则需要cGMP-PKG信号通路处于持续的激活状态.
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成年大鼠心肌细胞急性分离方法的探讨
目的:探讨成年大鼠心肌细胞急性分离过程中各种影响因素,建立稳定、高效、易重复的成年大鼠心肌细胞急性分离方法。方法成年SD大鼠麻醉后迅速取出心脏,悬挂在Langendorff装置上,用Ⅱ型胶原酶经升主动脉逆行灌流法分离大鼠心肌细胞,其间控制各种影响因素。结果分离即刻活细胞产量(3.2±0.4)×107,长杆状、横纹清晰;台盼蓝染色阴性的杆状细胞比率(86.7±5.3)%,经培养细胞可存活7天以上。结论通过调节和控制心肌细胞急性分离过程中的各种影响因素,可以获得高产量、高活性的心肌细胞。