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牛磺酸镁配合物对缺氧复氧致大鼠心肌细胞瞬时外向钾离子通道异常的影响
目的 研究牛磺酸镁配合物(TMCC)对缺氧复氧损伤所致大鼠心肌细胞异常瞬时外向钾电流(Ito)的影响.方法 采用Langendoff逆行主动脉灌注酶消化法急性分离大鼠单个心室肌细胞,分为空白对照组、模型组、100 μmol·L-1TMCC组、200 μmol·L- TMCC组、400 μmol·L-1 TMCC组和24.24 μmol·L-1胺碘酮组,均n=6.缺氧钾外液模拟缺氧15 min后用有氧钾外液复氧5 min制缺氧复氧模型.应用全细胞膜片钳技术记录名.结果 与空白对照组相比,模型组大鼠心室肌细胞Ito峰值显著增大(13.50±0.41 pA·pF-1 vs.8.40±0.66 pA· pF-1,P＜ 0.01),I-V曲线上移,Ito激活曲线左移；200、400 μmol·L-1 TMCC组和胺碘酮组均可使因缺氧复氧损伤增大的Ito减小(均P＜ 0.01),使I-V曲线下移并纠正左移的激活曲线.各组对稳态失活曲线均无显著影响,曲线无移动(均P＞ 0.05).结论TMCC可通过抑制钾通道的激活过程对抗缺氧复氧引起的Ito增大,提示该作用可能是TMCC抗缺氧复氧诱发心律失常的作用机制之一.
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膜片钳-激光扫描共聚焦显微镜同步实时控制系统的建立及其在心肌细胞膜钙离子通道研究中的应用
目的 建立膜片钳-激光扫描共聚焦显微镜同步实时控制系统,并将其应用于体外心肌细胞膜钙离子通道的研究,验证其应用效果.方法 通过在激光扫描共聚焦显微镜上加装膜片钳装置,采用计算机自动控制技术建立膜片钳与激光扫描共聚焦显微镜的同步实时控制系统；将建立好的装置应用于观察体外雄性大鼠心肌细胞膜钙离子通道,并分析观察结果.结果 成功建立膜片钳-激光扫描共聚焦显微镜同步实时控制系统；当刺激心肌细胞时,激光扫描共聚焦显微镜-膜片钳同步实时控制系统在通过激光扫描共聚焦显微镜观察钙火花的同时可通过膜片钳记录心肌细胞膜钙离子通道电流信号.定量分析结果表明相邻两个钙火花之间的时间间距分别为(10.055±0.021)、(10.079±0.021)、(10.087±0.021)s,符合膜片钳设定的刺激间隔(10 s)；单个钙火花在空间上均局限于2μm直径范围,在时间上平均经历了约30 ms,从出现至达到高浓度平均需10 ms,从达到高浓度到消失平均需20 ms,与钙火花理论吻合.结论 成功建立膜片钳-激光扫描共聚焦显微镜同步实时控制系统,在心肌细胞实现了在利用膜片钳进行全细胞记录观测和测定钙离子通道电流及其开闭时程的同时,利用激光扫描共聚焦显微镜获得了钙火花的显微结构形态图像,测定钙离子的位点变化,有助于进一步了解质膜钙离子通道的内部机制.
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Na+,K+-ATP酶在大鼠皮质神经元缺氧性损伤中的作用
目的:探讨缺氧对Na+,K+-ATP酶活性的影响,以及高亲和力Na+,K+-ATP酶和低亲和力Na+,K+-ATP酶在缺氧损伤中的不同作用.方法:通过切换低氧灌流液模拟大鼠脑片和原代培养的皮质神经元缺氧环境,以脑片膜片钳全细胞模式记录Na+,K+-ATP酶电流和膜电流,以可视化动缘探测系统测定培养的皮质神经元内钙离子浓度([Ca2+];),观察缺氧4 min时脑片皮质神经元Na+,K+-ATP酶电流的变化,以及缺氧2、4、6、8和10 min时在有、无哇巴因(Na+,K+-ATP酶阻断剂)存在情况下皮质神经元膜电流密度和[Cd2+];的变化.结果:缺氧4 min总Na+,K+-ATP酶电流密度(0.160±0.046 pA/pF)较缺氧前(0.265±0.068 pA/pF)显著降低(P＜0.01),但10 min缺氧可时间依赖性显著升高皮质神经元的膜电流密度(r=0.980 3,P＜0.01)和[Ca=2+];(r=0.973 4,P＜0.01);10μmol/L哇巴因可通过抑制低亲和力Na+,K+-ATP酶进一步增强此种缺氧所致的膜电流密度和[Cd2+];增大作用(P＜0.05或0.01),但10 nmol/L哇巴因则通过抑制高亲和力Na+,K+-ATP酶显著降低缺氧对二者的增大作用(P＜0.05或0.01).结论:Na+,K+-ATP酶活性改变参与了皮质神经元的缺氧性损伤,其中高亲和力Na+,K+-ATP酶与皮质神经元缺氧性损伤保护作用有关,而低亲和力Na+,K+-ATP酶则与其缺氧性损伤有关.
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烧伤血清对大鼠心肌细胞L型钙通道电流的激活作用
目的:观察烧伤血清(BS)对成年大鼠分离的心肌细胞膜钙通道电流的影响,探讨烧伤引起心肌细胞钙稳态变化的机制.方法:伤后2,6 h分离30%TBSA(Ⅲ度)烧伤的SD大鼠血清;逆行循环灌流、胶原酶消化分离心肌细胞;膜片钳技术全细胞记录模式测定细胞膜钙通道电流.结果:2 h BS使峰值L型钙电流(ICa-L)比对照组增加50%～80%;而6 h BS使峰值Ica-L增加1.5～2.5倍;峰值电压-电流曲线显示烧伤血清明显增加各个去极化钳制电压下的Ica,并使得大激活电压提前;细胞外液灌洗可去除烧伤血清对钙电流的作用.结论:烧伤血清能显著升高心肌细胞膜上钙通道电流,L型钙通道开放是烧伤后心肌细胞钙超载的机制之一.?
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缺血再灌注对人肾小管上皮细胞钾离子通道特性的影响
目的:应用缺氧模型模拟缺血再灌注损伤,观察缺血再灌注对人肾小管上皮细胞钾离子(K+)通道特性的影响.方法:取生长旺盛的人肾小管上皮细胞,进行同步处理后分正常组、缺氧组和氧损伤组3组(n=15),正常组细胞于无血清RPMI 1640培养液中常规培养,缺氧组和氧损伤组分别加入抗霉素A和H2O2制备化学缺氧模型和氧损伤模型,模拟缺血再灌注损伤.应用全细胞膜片钳技术记录3组肾小管上皮细胞膜钾离子通道特性.结果:3组肾小管上皮细胞膜K+通道表达的K+电流均具有电压依赖性,能被K+通道阻断剂Ba2+阻断;缺氧组和氧损伤组肾小管上皮细胞膜电压较正常对照组明显升高(P＜0.05),τ值小于正常对照组(P＜0.05),而缺氧组和氧损伤组之间无显著差异.结论:人肾小管上皮细胞膜上存在电压依赖性钾离子通道,缺血再灌注时其表达明显增加,活动明显增强.
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人和小鼠视网膜双极细胞的形态及功能比较
目的 比较人和小鼠视网膜视杆双极细胞形态和药物模拟对光反应的电流特性.方法 实验研究.对视网膜冰冻切片行免疫荧光染色,用PKC-α抗体标记视网膜视杆双极细胞,以观察其形态分布特点.在灌流充氧的情况下制备视网膜薄片切片,行视网膜ON型以及OFF型双极细胞的全细胞膜片钳记录.分别在ON型双极细胞和OFF型双极细胞上给予快速加药40 μmol/L LY3414925或100μmol/L AMPA,诱导出谷氨酸电流,以记录双极细胞模拟对光反应,并比较人和小鼠的谷氨酸电流动力学的差异,人和小鼠各项数据比较采用非参数检验(Mann-Whitney检验)进行处理.结果 人和小鼠的视网膜视杆双极细胞形态分布相似,但PKC-α表达略有不同.膜片钳结果显示人视网膜ON型双极细胞的模拟对光反应的上升相的达峰时间为(1.91±0.11)ms,与小鼠视网膜ON型双极细胞[(0.83±0.08)ms]相比明显较长(U=0.00,P＜0.01),而人视网膜ON型双极细胞的模拟对光反应恢复时间为(1.34±0.40)ms,明显短于小鼠[(20.06±3.07) ms](U=0.00,P＜0.01).但人和小鼠视网膜OFF型双极细胞电流动力学即电流幅度[人:(143.0±2.1)pA;小鼠:(136.3±2.2)pA]、反应上升时间[人:(1.91±0.35)ms;小鼠:(1.28±0.52)ms]和恢复时间[人:(220.5±10.8)ms;小鼠:(168.1±29.3)ms]差异均无统计学意义.结论 视杆双极细胞在人和小鼠视网膜中分布位置和形态大致相似.人和小鼠视网膜ON型双极细胞电流特性有差异.
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新生小鼠皮层神经元动作电位发放模式研究
目的:探究新生小鼠皮层神经元的动作电位发放模式及不同发放模式的电学特性.方法:使用全细胞膜片钳技术,结合电压钳和电流钳模式,采用出生3d小鼠皮层神经元观察不同神经元的主动和被动电学特性.结果:给予神经元去极化电流时记录到了三种动作电位发放模式:强直发放、阶段性发放和单个发放.比较三种动作电位发放模式的神经元的电学特性发现:①三种动作电位发放模式在神经元的电压依赖性内向和外向电流上存在差异;②三种动作电位发放模式的神经元在去极化电流阈值上也存在差异;③三种动作电位神经元在第一个动作电位的上升时间、宽度、幅值和阈值方面不同;④不同动作电位发放模式的神经元在被动电学特性上没有差异.结论:新生小鼠皮层神经元存在不同的动作电位发放模式,其电压依赖性内向电流和外向电流、动作电位形态、去极化电流阈值亦存在差异.
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膜片钳与单细胞RT-PCR联合研究的进展
上世纪80年代初发展起来的膜片钳(patch clamp)技术,有着强大的生物电记录和分析功能,已对神经科学等研究发挥了巨大的推动作用,德国的Neher和Sakmann也由此而获得1991年度的诺贝尔生理学或医学奖.但是,单纯的膜片钳技术仍不足以解释生命活动的许多现象,它也需要与其他技术结合运用,才能进行神经科学的综合性研究.随着分子生物学的迅速发展和推广应用,膜片钳技术与单细胞逆转录多聚酶链式反应(single cell RT-PCR)技术的结合,是神经科学研究中的一个重要发展方向.
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福辛普利预处理对缺氧复氧心室肌L型钙通道电流的影响
目的:观察福辛普利晚期预处理对缺氧复氧心室肌细胞L型钙通道电流的影响.方法:应用全细胞膜片钳方法,记录酶解的成年豚鼠心室肌细胞及福辛普利预处理后L型钙通道电流在缺氧复氧期的变化.结果:缺氧复氧期心室肌细胞L钙电流峰值明显下降,与对照组相比有明显差异(-237.71±17.70 pA vs-286.00±21.15 pA,P=0.0006,n＝7),L型钙电流电流-电压曲线上移;福辛普利预处理后心室肌细胞L钙电流峰值亦下降,但下降不明显(-265.57±20.20 PA vs-286.00±21.15 pA,P＝0.089,n=7)与缺氧复氧组比较有明显差异(P=0.018),L型钙电流电流-电压曲线上移幅度减小.结论:福辛普利可稳定缺氧复氧心肌L型钙通道电流,对心肌有保护作用.
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福辛普利晚期预处理对缺氧复氧期心室肌动作电位的影响
目的:观察福辛普利晚期预处理对缺氧复氧心室肌细胞动作电位的影响.方法:应用全细胞膜片钳方法,记录观察酶解的成年豚鼠心室肌细胞动作电位在缺氧复氧期的变化.结果:缺氧复氧的心室肌细胞膜静息电位增加,动作电位复极50时程(APD50)、APD90缩短(P均＜0.01).福辛普利预处理可使晚期缺氧复氧的心室肌细胞膜静息电位降低,APD50、APD90延长,虽不显著(P＞0.05).结论:福辛普利可稳定缺氧复氧心肌电生理活动,可模拟晚期预处理对心肌产生保护作用.
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急性低氧对家兔心室肌细胞钙、钾通道电流的影响
目的:研究急性低氧对单个家兔心室肌细胞L-型钙通道电流(L-Ica)、ATP敏感性钾通道电流(IK(ATP)以及短暂外向钾电流(Ito)的影响,以探讨急性低氧导致动作电位时程(APD)缩短的机制.方法:应用膜片钳全细胞记录方法.结果:低氧15分钟后心室肌细胞APD明显缩短(由491±57ms降至287±53ms,P＜0.01);L-Ica峰值降低(由1.57±0.29 nA降至0.83±0.15 nA,P＜0.01),电流-电压曲线上移;IK(ATP)通道开放,短暂外向钾电流(Ito)峰值增大(由4.76±0.43nA升至5.41±0.53nA,P＜0.05);复氧2分钟后,IK(ATP)受到抑制(由2.98±0.37nA降至610.9±42.1PA,P＜0.01).结论:急性低氧时APD的缩短是L-Ica、IK(ATP)以及Ito变化综合作用的结果.
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异丙肾上腺素对乳鼠窦房结细胞自动节律和钠钙交换电流的影响
目的：研究异丙肾上腺素（ISO）对乳鼠窦房结细胞自动节律和钠钙交换电流（INCX ）的作用。方法选12只新生24 h内Wistar大鼠乳鼠分离培养窦房结细胞，运用全细胞膜片钳技术记录动作电位（AP）和 INCX电流。结果于细胞外加入 ISO 1．0μmol／L 后，AP 的发生频率明显增加，从（147．9±9．9）min－1增加至（278±11．2） min－1。ISO可使＋80 mV起始时外向 INCX密度从（0．52 ± 0．03）pA／pF增加至（0．72 ± 0．04）pA／pF （n＝10，P＜0．05），平均增加约36．7％；而－120 mV时内向电流从（－3．26 ± 0．02）pA／pF增加至（－7．81 ± 0．06） pA／pF（n＝10，P＜0．01）。此效应呈现电压依赖性和浓度依赖性特征。结论乳鼠窦房结细胞 INCX参与窦房结自动去极化，ISO可使其作用增加。
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内皮素1对豚鼠心室肌细胞正常和急性缺血状态L型钙通道电流的影响
目的探讨内皮素1(ET-1)对正常和急性缺血状态下豚鼠心室肌细胞L型钙通道电流(ICa-L)的影响. 方法应用全细胞膜片钳技术记录豚鼠心室肌细胞单一ICa-L. 结果 5,10,50 nmol/L的ET-1分别使正常状态心室肌细胞ICa-L的峰值明显增加(均P<0.05);但在模拟缺血低氧条件下ET-1对ICa-L的峰值和大激活电位无明显影响. 结论 ET-1对正常豚鼠心室肌细胞ICa-L有明显的浓度依赖性增强作用;在急性缺血条件下该增强作用消失.
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急性缺血对豚鼠心室肌细胞L型钙通道电流的影响
目的观察急性缺血对豚鼠心室肌细胞L型钙通道电流(ICa-L)的影响. 方法采用膜片钳全细胞记录方法,分别于模拟急性缺血后0, 5, 10, 15和20 min记录ICa-L. 结果模拟急性缺血状态后豚鼠心室肌细胞ICa-L明显受抑,L钙电流峰值大值较对照组下降25.65%±4.13%(P<0.05);但其大活性电压和ICa-L的I-V曲线形态无明显改变. 结论模拟急性缺血状态可明显抑制豚鼠心室肌细胞L型钙通道电流,但不影响大活性电压和ICa-L的I-V曲线形态.
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Egb761抑制谷氨酸受体拮抗大鼠海马神经元兴奋毒损伤
目的 观察银杏叶提取物Egb761对海马神经元谷氨酸(Glu)兴奋毒性损伤的保护作用及其机制.方法 采用DAPI染色和TUNEL法检测Glu诱导的海马神经元细胞凋亡及Egb761的保护作用,采用全细胞膜片钳技术记录Egb761对大鼠海马神经元Glu受体电流的抑制作用.结果 Egb761拮抗Glu孵育诱导的海马神经元凋亡样死亡,其分子机制可能是抑制N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)型和海人酸(KA)型Glu受体.结论 银杏叶提取物Egb761通过抑制Glu离子通道而拮抗Glu对海马神经元的兴奋毒作用.
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Aβ1-42对胆碱能神经元KATP通道离子流影响的研究
目的 研究B淀粉样蛋白(Aβ1-42)时胆碱能神经元ATP敏感钾离子(KATP)通道离子流的影响.方法 原代培养出生24 h内的乳鼠皮层和海马胆碱能神经元,采用膜片钳全细胞记录技术记录Aβ1-42对单个胆碱能神经元KATP通道离子流的影响.结果 与对照组比较,给予Aβ1-42后胆碱能神经元外向电流显著减少(P<0.05),再给予ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪后此减小的外向电流无显著变化(P>0.05).结论 Aβ1-42对神经元KATP通道具有抑制作用.
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低分化鼻咽癌细胞的自发氯电流特性
目的：研究自发的低分化鼻咽癌细胞（ CNE-2Z）氯电流特征。方法采用全细胞膜片钳记录自发的CNE-2Z细胞氯电流，通过去除电极内液中的ATP、细胞外灌流氯离子通道阻断剂或高渗液等方法观察并分析电流的特性。结果细胞处于等渗环境中可自发激活一个具有明显外向优势的电流，该电流没有明显的时间依赖性失活，电流的翻转电位为（-7．6±0．9） mV，接近氯离子平衡电位（-0．9 mV）。该电流的激活依赖于细胞内ATP。氯通道阻断剂ATP可抑制该电流，且其对外向电流的抑制作用大于内向电流。细胞外灌流高渗液对该电流有明显抑制作用。结论 CNE-2Z细胞处于等渗环境中可自发激活一个电流特征与容积敏感性氯通道相似的氯通道。
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发育中的海马神经元离子通道功能变化
目的研究发育中的海马神经元电压依赖性钠、钾、钙离子通道(VDCCs)及N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体通道电流幅度的变化.方法应用膜片钳技术分别对培养日龄为6、16 d海马神经元电压依赖性钠、钾、钙离子通道及NMDA受体通道电流进行全细胞记录,研究其离子通道电流幅度变化.结果与培养日龄为6 d海马神经元相比,培养日龄为16 d海马神经元电压依赖性钠离子通道电流大幅值无显著差异;其电压依赖性钾离子通道电流大幅值显著增加(P＜0.05);其VDCCs大幅值亦显著增加(P＜0.001);其NMDA受体通道电流大幅值显著增加(P＜0.05).结论随着海马神经元发育,其电压依赖性钾、钙离子通道及NMDA受体通道功能更趋成熟,其电压依赖性钠离子通道功能则无显著变化.
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槲皮素对人肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的激活作用
目的:观察槲皮素对人肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾通道(KCa)的影响,以探讨槲皮素在分子水平扩张血管的作用机制.方法:选取需择期行腹部手术并且血压正常的患者14例,取肠系膜动脉小分支,用急性酶消化法获得单个肠系膜动脉平滑肌细胞.然后应用单通道细胞膜片钳技术观察不同浓度槲皮素对肠系膜动脉平滑肌细胞KCa通道开放概率(NPo)、电流幅度值(Am)、平均开放时间(To)、平均关闭时间(Tc)等各指标的影响.结果:在内面向外式方式下,随着浴液中槲皮素浓度的增高,通道NPo明显增高:槲皮素浓度100μmol/L时,NPo由用药前(即0 μmol/L)的0.028 62±0.011 99增高到0.147 03±0.058 17(P＜0.01);通道Am、To变化不大(P＞0.05);而通道Tc明显缩短:由用药前(477.650±376.650)ms缩短到(112.643±114.365)ms(P＜0.01).结论:槲皮素能直接激活人类血管平滑肌细胞KCa通道而实现降血压效应.
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阿魏酸钠对家兔心室肌细胞钾通道电流的影响
目的:探讨阿魏酸钠对家兔心室肌细胞膜延迟整流钾电流快速与缓慢激活成分(IKr、IKs)、内向整流钾电流(IK1)、瞬时外向钾电流(Ito)的影响.方法:酶解法分离单个家兔心室肌细胞,以经典的Ⅲ类药胺碘酮为对照,采用全细胞膜片钳技术记录浓度为3.0、10.0、30.0,100.0 μmol/L的阿魏酸钠对IKr,IKs、IK1、Ito的作用.结果:阿魏酸钠的作用弱于胺碘酮,二者均可浓度依赖性抑制IKr、ILs时间依赖性外向电流及尾电流(IKr,tail、IKs,tail).不同浓度的阿魏酸钠对IKr,tail的抑制率为:(12.1±2.5)%、(24.1±3.0)%、(47.0±5.8)%及(58.5±8.3)%(n=5,P＜0.05);对IKs,tail的抑制率为:(15.6±6.4)%、(27.1±6.5)%、(45.6±5.8)%及(51.8±6.6)%(n=5,P＜0.05),其对IKr,tail及IKs,tail的半数抑制浓度(IC50)均大于胺碘酮(43.6:3.48 μmol/L,44.9:5.11 μmol/L).30.0、100.0 μmol/L阿魏酸钠及10.0、30.0 μmol/L胺碘酮可使IK1的I-V曲线左移,在-100 mV及-20 mV测试电压下,阿魏酸钠对IK1内向、外向电流抑制率小于胺碘酮(n=5,P＜0.05).阿魏酸钠与胺碘酮均不影响Ito及其I-V曲线.结论:阿魏酸钠复合阻滞复极期多种钾电流,可能是其抗心律失常作用的电生理机制之一.
