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无义突变通读诱导剂研究进展
随着大量新化学物的合成,以及各种工业废物的排放,人类接触环境化学致突变物的机会越来越多.化学致突变物可在人体内诱导各种基因突变,包括无义突变[1].在人类所有致病基因的突变类型中,30％的突变属于无义突变[2].无义突变可使mRNA形成提前终止密码子(Premature stop codon,PTC),从而导致mRNA翻译在突变位置提前终止,生成无功能或功能不完全的蛋白质,甚至造成编码蛋白缺失,导致疾病发生.无义突变是遗传病的主要病因之一,约12％的遗传病由无义突变引起.无义突变也和肿瘤发病密切相关,已在超过480种肿瘤相关基因内被发现,特别是抑癌基因的无义突变发生频率较高.
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重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株的构建及意义
本研究构建重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株并探讨其意义.将人凝血因子Ⅸ(F9)小基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag3B上；利用PCR定点突变技术得到在小基因121位氨基酸位置含有一个提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的无义突变体；将构建的F9小基因及其无义突变体分别转染人肝癌细胞HepG2,经G418抗性筛选,单克隆化扩大培养,得到稳定细胞株,分别命名为HepG2-WT和HepG2-N.结果显示:通过酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析证明,小基因及其无义突变体表达载体构建成功；通过RT-PCR及基因组PCR均扩增到了大小正确的目的基因片段,证明了含有重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体的稳定细胞株构建成功.结论:本研究成功构建了重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株,该细胞株可用于无义突变导致血友病的治疗药物的筛选和PTC通读药物的筛选等.
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氨基糖苷类抗生素治疗无义突变致遗传性疾病的研究进展
无义突变(nonsense mutation)可以导致多种遗传性疾病的发生.编码某一氨基酸的三联体密码经碱基替换后,产生提前终止的无义密码子(premature termination codons,PTCs),使肽链的合成提前终止,生成没有功能或者是功能不完整的蛋白质,导致了疾病的发生.研究发现,一些与核糖体结合的药物,如氨基糖苷类抗生素和某些人工合成的小分子物质,能够使氨基酰-tRNA通过提前出现的转录终止位点,产生完整的蛋白质并且恢复蛋白质的功能,从而改善疾病的症状,为治疗无义突变引起的遗传性疾病提供了广阔的前景.
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氨基糖甙类药物恢复HERG通道无义突变体的功能
目的 本研究旨在探讨氨基糖甙类药物对纯合和杂合的HERG无义突变体的作用效应.方法 采用聚合酶链反应法制备HERGR1014X突变体,并克隆至真核细胞表达载体中.将突变体的cDNA瞬时转染至HEK293细胞,应用全细胞膜片钳技术记录通道电流.药物拯救采用将转染24h后的HEK293细胞在含G-418或庆大霉素(终浓度为400μg/mL)的培养液中孵育24h.结果 R1014X能表达典型的HERG样电流,尽管与野生型(wild type,WT)HERG相比,大尾电流幅值明显F降(3.9±1.4 pA/pF,n=8,vs.47.8±6.3 pA/pF,n=12,P＜0.01).经过G-418和庆大霉素干预后,R1014X的大尾电流密度分别增加至12.7±3.3 pA/pF(n=7,P＜0.05)和18.3±3.7 pA/pF(n=8,P＜0.05).药物干预使R1014X的激活动力学特性亦得到恢复.Western blot和共聚焦检测进一步证实,氦基糖甙类能促进全长的HERG通道蛋白的表达.G-418和庆大霉素对杂合的WT/R1014X通道作用效应不同:庆大霉素能使WT/R1014X的电流增加2.2倍(n=12,P＜0.05),G-418却无明显效应.结论 氯基糖甙类药物能恢复无义突变的HERG通道的功能性表达,且对纯合和杂合通道均有效,这为遗传性心律失常的治疗提供了新的思路.
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不同浓度药物PTC124和G418对HERG通道无义突变体的作用
目的：通过对HERG基因无义突变体应用不同剂量PTC124和G418来观察其通道功能的恢复情况，并探讨药物的作用机制。
方法：制备HERG基因R1014X突变体，将野生型（WT）HERG及R1014X分别瞬时转染至HEK293细胞，转染24 h后将其置入含不同浓度的PTC124和G418的培养液中孵育24 h。逆转录聚合酶链反应法检测各组细胞HERG信使核糖核酸（mRNA）的表达，蛋白印迹法检测野生型和R1014X给药前后通道蛋白的表达，全细胞膜片钳技术记录通道电流以评价HERG基因编码通道的功能性表达。
结果：与野生型相比，R1014X突变体编码的通道蛋白的蛋白条带变短，蛋白量及mRNA水平无明显差异（P>0.05）。药物PTC124和G418均能恢复R1014X完整蛋白的表达，并呈剂量依赖性变化（P<0.05），PTC124的作用弱于G418（P<0.05）。药物干预后，R1014X突变体HERG通道的功能得到不同程度的恢复，其大尾电流密度由（4.75±0.88） pA/pF分别增加至（9.62±0.73） pA/pF （PTC124，P<0.05）和（22.57±2.26） pA/pF （G418,P<0.05），G418作用使通道的半激活电压得到恢复（P<0.05），差异均有统计学意义。
结论：药物PTC124和G418能不同程度恢复HERG基因无义突变的结构和功能性表达，其恢复HERG基因的蛋白表达呈剂量依赖性变化。 -
ARID1A抑癌基因的研究进展
自2010年Wiegand等[1-2]证实AT丰富结合域1A(AT rich interaction domain 1A,ARID1A)基因突变与卵巢透明细胞癌密切相关以来,陆续有研究发现在多种肿瘤中存在该基因的突变.由于人类肿瘤中绝大多数涉及ARID1A的体细胞突变机制为插入或缺失导致的框移或无义突变,ARID1A被认为是候选的肿瘤抑制基因.ARID1A基因编码BAF250a蛋白,后者是SWI/SNF染色质重塑复合物的一个关键组分[3],不仅对细胞增殖和肿瘤抑制起重要作用,亦与糖皮质激素的敏感性有关.本文就相关研究进展作一综述.
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新药研究与开发
治疗无义突变囊性纤维化肺病新药 ataluren 的Ⅲ期临床试验结果ataluren 治疗无义突变囊性纤维化肺病的Ⅲ期临床试验，入选238名患者，是双盲、ataluren 和安慰剂比较的48周研究。ataluren 治疗组（早10 mg/kg，中10 mg/kg，晚20 mg/kg）与安慰剂组分别治疗48周时，以1秒用力呼气容积（FEV1）作指标，给药组平均改变-1.8%，安慰剂组平均改变-4.3%；肺症状较基线加重者，给药组较安慰剂组少23%；在不用妥布霉素吸入的患者中，给药效果更好；以 FEV1作指标，给药组平均改变-0.7%，安慰剂组平均改变-6.4%；肺症状较基线加重者，给药组较安慰剂组少40%。
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无义突变通读药物研发进展
无义突变与众多疾病发生有关,包括肿瘤和遗传病.某些化合物如氨基糖苷类抗生素、非氨基糖苷类抗生素及其他小分子化合物能诱导无义突变通读,从而翻译出有功能的全长蛋白.化合物诱导的无义突变通读对于遗传病及肿瘤治疗是一个非常有潜力的治疗策略,但目前没有几种化合物显示出确切的临床疗效.因此,急需筛选新型、更具药物特性的化合物,推动通读治疗走向临床.本文详细介绍了无义突变通读药物的研究现状,为新药开发提供参考.
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LP 小鼠突变基因的定位及鉴定
目的：以卷尾突变C57 BL／6 J小鼠为研究对象，通过微卫星定位以及候选基因测序分析确定突变基因位点。方法将LP小鼠与正常C57BL／6J及C3H小鼠交配，记录了后代中卷尾与正常小鼠的数目，确定卷尾突变表型的遗传模式。微卫星D1Mit113和D1Mit149对突变基因进行了精确定位，确定候选基因。 PCR扩增候选基因片段直接测序并进行序列分析。用FspBI（ BfaI）内切酶鉴定LP小鼠杂交后代的基因型。结果 LP突变呈单基因不完全显性遗传，在不同的遗传背景中存在表型差异；Vangl2基因编码区1345bp处碱基由C→T。结论 Vangl2基因C→T的突变是一种无义突变，导致蛋白编码提前终止，是引起卷尾突变的原因；杂交LP小鼠后代中未出现纯合子小鼠，证明Vangl2基因突变纯合子致死。
关键词： C57BL/6J小鼠 LP Vangl2基因 无义突变 -
无义突变药物治疗的研究进展
随着分子生物学和遗传学研究的不断进展,遗传性疾病越来越引起人们的关注.遗传性疾病分为单基因遗传、多基因遗传和染色体异常三大种类,多是由基因突变引起,其中基因突变根据其对基因的影响可分为三种,包括同义突变(same sense mutation)、错义突变(missense mutation)和无义突变(nonsense mutation).无义突变是指因为某个碱基的改变,使代表某种氨基酸的密码子突变为早熟终止密码子(premature termination codon,PTC),从而使肽链合成提前终止,形成不完整的、无功能的肽链,使基因无法合成蛋白质发挥作用而导致发病.其中根据统计人口的不同,无义突变引起的发病占病例总数的5％～70％[1]不等,近些年来,无义突变的药物治疗越来越引起学者的关注.
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抗早发性无义突变疾病药物研究进展
随着后基因组时代的到来,基因芯片和大规模测序技术的日趋完善,各种遗传疾病的病因学原理逐步被人们所了解,个性化治疗也渐渐进入了人们视野.由于遗传、基因突变(无义突变、移码突变、内含子错误剪切)或者后天性获得的原因,在基因组中正常终止密码子的上游,形成了一个提前的终止密码子,称为早发性无义突变(premature stop codon,PTC).在下游的蛋白质翻译过程中,肽链合成在早发性无义突变处提前终止,肽链的大量缺失或者产生没有功能的截短型蛋白质,导致疾病的发生.经人类基因组突变数据库(Human Genome Mutation Database,HGMD Professional re-lease,http://www.hgmd.org)2012年的权威统计,无义突变(nonsense mutation)是多种遗传疾病的病因,其中大约11.2％是由于早发性无义突变引发的.另外,很多肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)由于早发性无义突变的存在,使得细胞凋亡途径改变,产生肿瘤[1].
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用于囊性纤维化和肌营养不良的药物Ataluren
体内合成的囊性纤维变性膜透性调节蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)和抗肌营养不良蛋白结构不完整和功能异常所引起的囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)和杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)均是遗传性疾病,病因是患者的相关基因发生无义突变(即单个核苷酸发生突变),导致mRNA转录过程中的终止密码子(UAA、UAG和UGA)提前产生,从而使合成的相关蛋白质分子短小,且功能丧失.
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一个遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系的基因分析
目的:对一个遗传性凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺陷症家系进行FⅪ基因突变的分析和家系调查,探讨其分子发病机制.方法:检测先证者及其家系成员活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血因子Ⅷ活性(FⅧ:C)、凝血因子Ⅸ活性(FⅨ:C)、凝血因子Ⅻ活性(FⅫ:C)、FⅪ活性(FⅪ:C)和FⅪ抗原(FⅪ:Ag)含量等进行表型诊断;用DNA直接测序法分析先证者FⅪ基因所有15个外显子、侧翼、5'和3'非翻译区及家系成员相应的突变位点区域,用反向测序证实所发生的突变.结果:先证者APTT延长为50.0 s (正常为27.0~41.0 s),先证者弟弟与儿子APTT同样延长,分别为53.7 s和51.8 s,家系其他成员APTT无明显延长;先证者及其弟弟、儿子、父亲的FⅪ:C明显减低,分别为22.5%、22.3%、35.5%和42.0%,FⅪ:Ag含量分别为29.0%、18.0%、29.0%和40.0%,表现为交叉反应物质(CRM)阴性;先证者母亲凝血指标均在参考范围内.基因测序发现先证者及其父亲、弟弟、儿子FⅪ基因第8号外显子存在C16642T杂合无义突变,导致编码第263位氨基酸谷氨酰胺提前出现终止密码(Gln263stop).结论:FⅪ基因第8号外显子C16642T杂合无义突变是导致该遗传性FⅪ缺陷症家系FⅪ水平降低的主要原因.
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重新研究TP53基因突变和免疫组化的关系--157例弥漫型胶质瘤的对照分析
p53免疫组化与TP53突变状态之间的关系一直存在争议。本组研究重新评估p53免疫组化提示TP53突变状态的价值。通过外显子测序,共检测了157例弥漫型胶质瘤( WHO Ⅱ~Ⅳ级)冷冻组织的TP53基因第4~10外显子。对应所有病例的福尔马林固定石蜡包埋组织检测p53免疫组化(克隆号DO-7),评估表达强度和比率。66例突变病例中发现72个突变,包括60个错义突变,5个无义突变,4个缺失和3个剪切位点变异。通过 ROC曲线分析发现大于10%的肿瘤细胞强阳性可大程度地提示突变。
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全外显子组测序发现 Merkel细胞癌存在RB基因突变
Merkel细胞癌是一种罕见的高度侵袭性的皮肤神经内分泌肿瘤,约80%的病例与Merkel细胞多瘤病毒( MCV)感染有关,病毒大 T 抗原持续表达可能是其发生机制之一。MCV阳性与阴性的Merkel细胞癌在临床表现和形态学上存在重叠,目前分析大多关注MCV阳性Merkel细胞癌的发生机制,对阴性病例则认识不足。本文应用外显子组测序分析5例MCV阳性和3例MCV阴性的Merkel细胞癌样本的基因变异情况。结果发现两组病例在点突变、DNA拷贝数改变、插入缺失以及染色体重组等变异的总数上差异无显著性。此外,研究发现RB1信号途径相关基因存在频发突变,3例MCV阴性病例均出现RB1基因无义突变导致截短蛋白产生,而阳性病例则未发现此突变类型。免疫组化结果证实病例均存在RB1异常调控。作者认为,大T抗原持续表达和宿主体细胞突变均能导致 RB1信号通路失调,可能是MCV阳性与阴性肿瘤表型相似的原因,提示Merkel细胞癌存在病毒依赖和非依赖两种发生机制。
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无义突变引起的遗传性疾病及其治疗新药的研究进展
无义突变(nonsense mutation)是一类特定类型的基因突变.文章综述了无义突变及其引起的遗传性疾病,治疗这类疾病新药的发展,PTC124及其作用机制以及对杜兴肌营养不良和囊性纤维变性等的药效学研究进展.
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中国一先天性无虹膜家系的遗传分析及PAX6基因突变位点的检测
背景 先天性无虹膜是双眼发病的遗传性疾病,目前的研究表明先天性无虹膜患者配对盒转录因子6(PAX6)基因突变位点具有多样性. 目的 通过目标序列捕获测序结合一代测序验证技术对1个中国先天性无虹膜家系进行基因突变位点的筛查和遗传分析.方法 采用横断面研究方法,本研究组于2016年3月纳入在郑州大学第一附属医院确诊的1个中国汉族先天性无虹膜家系,并对该家系成员进行致病突变基因检测.该家系全体成员均接受神经系统、口服葡萄糖耐量试验等全身体格检查以及眼科相关检查.采集现存家系所有成员前臂静脉血10 ml以提取基因组DNA,以先证者基因组DNA为模板行前房角发育异常致病基因的目标基因定点捕获测序分析,经与各基因库比对筛选出候选致病基因位点,采用PCR法对该家系成员行致病基因位点DNA片段扩增,采用Sanger测序技术在该家系除先证者以外的2例患病者和表型正常成员中进行候选致病基因验证. 结果 该家系共3代9名成员,Ⅰ1去世,现存8位成员,包括患病者3例(Ⅱ2及其子代Ⅲ1、Ⅲ2)和表型正常者5人,符合常染色体显性遗传模式.所有家系成员未发现神经系统异常,口服葡萄糖耐量试验结果均呈阴性.3例患病者视力均明显下降且不能矫正,眼压平均值为21 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),患者均存在虹膜完全缺如、角膜基质层混浊、眼球水平震颤、黄斑中心凹发育不良症状.此外,Ⅱ2患者存在左眼上睑下垂、右眼先天性白内障表现,Ⅲ2同时存在双眼先天性白内障、双侧晶状体不全脱位.先证者目标序列捕获测序分析及数据库比对显示,所有患病者PAX6基因第6号外显子上碱基替换c.183C＞A,经Sanger测序验证后证实突变基因与表型共分离. 结论 PAX6基因c.183C＞A突变是该先天性无虹膜家系的致病突变位点.
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致LQT2的无义突变的HERG通道的表达和药物拯救研究
目的 本研究旨在探讨氨基糖苷类抗生素庆大霉素在异源表达系统中对导致长QT综合征2型的无义突变的HERG通道的作用.方法 采用聚合酶链反应法制备相关突变体--W927X、R863X和E698X,并克隆到真核细胞表达载体中.将突变体的cDNA瞬时转染至HEK293细胞,应用全细胞膜片钳技术记录通道电流.药物拯救采用将转染24 h后的HEK293细胞在含庆大霉素(400 μg/mL)的培养液中孵育24h.结果 W927X能表达典型的HERG电流,尽管与野生型HERG相比,电流幅值明显下降;R863X和E698X仅表达与未转染细胞上类似的内生性电流,说明未能形成功能性的HERG通道.庆大霉素能增强W927X的功能性表达,使其大尾电流密度由11.6±2.4 pA/pF(n=8)增至19.5±2.7 pA/pF(n=7, P<0.05).通道激活动力学特征在野生型HERG、W927X和W927X加庆大霉素干预组均没有明显差异.然而,庆大霉素对R863X和E698X并无明显作用.结论 氨基糖苷类抗生素能部分恢复无义突变的HERG通道的功能性表达,且对不同的突变体其作用效应不同.
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触发心房颤动的突变
美国科学家通过一例早年发病,通常治疗无效的孤立性心房颤动(AF)患者识别出KCN45基因(编码钾通道电压门控KV1.5蛋白)的一种无义突变,断裂心房特异的KV1.5通道,提供一种电不稳定性和易患AF的分子底物.
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细胞外钾对 HERG 基因无义突变L539 fs／47表达的调控
目的：研究持续细胞外钾对野生型HERG与其突变体L539fs／47蛋白表达的影响。方法：用脂质体转染法将野生型HERG（WT）及其突变体HERG-L539fs／47（MT）分别转染HEK293细胞36 h后，0.8、4.3及10 mmol／L的钾干预6 h，流式细胞术检测HERG蛋白表达量；干预12 h用激光共聚焦成像和免疫印迹法进行HERG蛋白定位及表达量检测。结果：用激光共聚焦成像检测发现野生型HERG蛋白主要分布在细胞膜上；而HERG突变体L539fs／47蛋白大部分滞留胞浆；并且HERG蛋白的表达均随细胞外钾浓度升高而增多。流式细胞术结果显示细胞外高钾组荧光增多（ P＜0.01），WT组荧光阳性细胞百分比和荧光强度均高于MT组（ P＜0.05）。免疫印迹显示，不同于野生型HERG 135 kD及155 kD 2个条带，突变体仅60 kD 1个条带，3个条带均受细胞外钾影响（ P＜0.05）。结论：细胞外高钾增强细胞膜上野生型和突变型HERG通道蛋白的稳定性，持续低钾干预时间依赖性地减少HERG通道蛋白的表达。
