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HERG基因突变致第二型长QT综合征机制的研究进展
HERG基因编码快速激活延迟整流钾通道的α亚单位,快速激活延迟整流钾电流在心脏复极过程中起着极其重要的作用,HERG基因的突变导致快速激活延迟整流钾电流的异常,并进一步引起第二型遗传性长QT综合征((LQT2).随着研究方法的不断发展,人类对HERG基因突变引起LQT2的机制的了解越来越深刻,作者就此作一综述.
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先天性长QT综合征KVLQT1和HERG基因新突变位点的检测
目的研究中国人先天性长QT综合征(1ong QT syndrome,LQTS)HERG和KVLQT1的基因突变情况.方法利用聚合酶链反应和DNA测序对11个LQTS家系HERG跨膜编码区S1～S6和KVLQT1跨膜编码区S2～S6进行基因检测.结果 (1)11个LQTS患者在国外已知突变点均无突变;(2)发现4个新的错义突变位点,分别为T1515G(HERG),C682T,C934T,G983A(KVLQT1).其对应的氨基酸改变为E505D,R228C,S230L,P312S和R328C.结论在中国人LQTS患者HERG和KVLQT1上发现了4个新的基因突变位点.
关键词： 长QT综合征 KVLQT1基因 HERG基因 新突变点 尖端扭转性室性心动过速 -
pcDNA3-HERG转染抑制苯肾上腺素诱导的心肌细胞肥大的动物实验
目的 探讨HERG基因真核表达质粒pcDNA3-HERG(编码人快激活延迟整流钾通道α亚单位)转染抑制α1肾上腺素能受体激动剂苯肾上腺素(phenylephrine,PE)诱导的乳兔心室肌细胞肥大的电生理机制.方法 培养乳兔心室肌细胞,观察10μmol/L PE作用6 h和48 h心肌肥大指标(细胞体积、总蛋白含量及膜电容)、动作电位时限(APD)及钙调神经磷酸酶(CaN)活性的变化;以真核表达质粒pcDNA3-HERG转染心室肌细胞,观察转染细胞经PE诱导48 h后上述指标的变化.结果 PE作用6 h,心室肌细胞动作电位复极达90%时限(APD90)延长14.3%(P＜0.05),而此时并无心肌肥大和CaN活性增加.PE作用48 h,心室肌细胞APD90延长18.8%(P＜0.05),细胞体积、总蛋白含量、膜电容以及CaN活性分别增加40.0%、41.8%、36.4%、124.1%(P＜O.01);pcDNA3-HERG转染可过度表达IHERG,其尾电流密度约为未转染HERG组快激活延迟整流钾电流(Ikr)尾电流密度的4倍(P＜0.05),可促进复极,明显缩短PE引起的APD90延长(P＜0.05),显著抑制PE诱导心肌肥大和CaN活性增加.结论 PE诱导乳兔心室肌细胞肥大过程中,APD延长并非继发于而是早于心肌肥大.APD延长,继而导致Ca2+内流和胞内Ca2+增加,激活CaN信号通路可能在PE诱导心肌肥大中起重要作用.
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盐酸关附甲素对转染HERG基因表达的快速激活延迟整流钾通道电流的影响
目的 用膜片钳全细胞记录法观察盐酸关附甲素(AHH)对转染HERG基因表达的快速激活延迟整流钾电流(IKr)的影响.方法 使用脂质体介导的瞬时转染法把野生型HERG基因转染人人胚肾细胞(HEK293),采用标准的全细胞膜片钳技术记录IKr通道电流,观察不同浓度的AHH对IKr的影响.结果 AHH对IKr通道的峰电流IHERC具有浓度和电压依赖性抑制作用,半数大抑制浓度(IC50)为465.95 μmol/L;400 μmol/L的AHH使IHERG的大峰值电位前移,但不改变激活电位.25、100、400、1000、2500 μmol/L的AHH对尾电流(Itail)抑制率分别为1.53%、13.60%、-5.92%、30.14%、38.51%.100和400 μmol/L的AHH使激活曲线左移并能加快通道的失活.结论 25～400 μmol/L的AHH对IKr的抑制作用不明显;AHH主要是作用于IKr通道的失活态.
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干扰HERG钾通道表达可抑制成神经细胞瘤细胞增殖
目的:采用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术抑制HERG基因的表达,探讨HERG基因编码钾通道对人成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y)存活及增殖的影响.方法:构建发卡状RNA干扰质粒(shRNA-HERG)转染SH-SY5Y细胞,再分别使用半定量RT-PCR和Western印迹方法观察shRNA-HERG 对SH-SY5Y细胞中HERG基因mRNA及其编码蛋白表达的干扰效果.利用SH-SY5Y细胞的生长曲线和集落形成实验,观察转染shRNA-HERG质粒对SH-SY5Y细胞存活及增殖能力的影响.结果:转染shRNA-HERG干扰质粒后,SH-SY5Y细胞中HERG基因的mRNA水平及其编码的钾通道蛋白表达水平显著下降.与对照组相比,shRNA-HERG使SH-SY5Y细胞生长曲线明显下压,细胞倍增时间延长136.8%.集落形成实验结果显示,无论接种细胞数为50,100或200,shRNA-HERG组克隆形成率均显著下降,与shRNA-control组和未干扰组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:所构建的shRNA-HERG表达质粒能有效抑制HERG基因编码钾通道蛋白的表达,明显抑制SH-SY5Y细胞的生长和增殖.
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盐酸关附甲素对HERG基因F656C突变钾通道的影响
目的:评价盐酸关附甲素(AHH)对HERG基因F656C突变表达的钾通道的影响.方法:采用标准的全细胞膜片钳技术记录不同浓度的AHH对F656C突变表达的快速激活延迟整流钾电流(I_(Kr))的影响;应用免疫蛋白印迹技术(Western blot)评价AHH对HERG钾通道蛋白的影响.结果:AHH对突变后I_(Kr),通道的峰电流(I_(HERG))和尾电流(I_(tail))具有抑制效应,并使得激活曲线左移.高浓度的AHH可抑制HERG钾通道蛋白的转运,且对F656C突变表达的HERG钾通道蛋白抑制更明显.结论:AHH主要是结合在HERG通道的S6区从而抑制钾电流.AHH不影响HERG蛋白的合成,但高浓度的AHH可抑制HERG蛋白的转运.
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HERG钾离子通道与药物心脏毒性的安全性评价
人类ether-a-go-go相关基因(HERG)编码的快速延迟整流钾离子通道(Ikr)的α亚基介导的快速延迟整流钾电流在心肌动作电位复极过程中发挥着重要作用.HERG功能的缺失及药物抑制影响心脏动作电位复极过程,并会引起QT间期延长,同时可能诱发尖端扭转型室性心动过速,导致心律失常.HERG钾离子通道作为抗心律失常药物治疗的标靶,同时也越来越体现出在新药安全性检测和新药开发过程中的重要作用.
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长QT综合征2型HERG基因绿色荧光真核表达载体的构建及表达
目的 构建先天性长QT综合征2型HERG基因绿色荧光真核表达载体pEGFP-C2-HERG,并检测其于活体细胞中表达及定位. 方法 采用限制性内切酶双酶切法和基因重组技术将HERG基因片段构建到真核表达载体pEGFP-C2中,通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序验证;构建成功的pEGFP-C2-HERG真核表达载体用脂质体转染法转染HEK293细胞后通过蛋白免疫印迹法再次鉴定重组蛋白的表达,并通过激光共聚焦显微镜观察其荧光蛋白表达及定位. 结果 琼脂糖凝胶电泳证实新构建的真核表达载体pEGFP-C2-HERG碱基大小正确,DNA测序提示HERG基因碱基序列与模板一致,新构建表达载体成功转染入HEK293细胞并于细胞膜上成功表达. 结论 成功构建pEGFP-C2-HERG真核表达载体,转染入HEK293细胞并于细胞膜上成功表达通道蛋白;此方法构建的表达绿色荧光的真核表达载体为药物筛查、突变型基因的研究奠定了基础.
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一中国先天性长QT综合征家系的基因突变分析
目的:检测并分析一中国先天性长QT综合征(Congenital long QT syndrome,LQTS)家系的基因突变.方法:分析根据家系的临床症状及心电图,初步判断出基因分型,聚合酶链反应法扩增基因的全部外显子并用DNA直接测序法检测基因突变.结果:患者临床表现符合HERG基因突变所致LQT2,DNA测序发现HERG基因1682位点C→T错义突变,致使氨基酸第561位密码子丙氨酸被缬氨酸取代(A561V),该突变位于HERG基因突变热点区域,为国内首次发现.结论:发现中国人HERG基因新突变,中国LQT2家系中患者具有与欧美及日本患者相同的致病突变.
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心律失常离子通道病与药物作用新靶点
目的研究离子通道病的特征及新靶点.方法人淋巴球的cDNA,L-甲状腺素致心肌肥大,mRNA表达及膜片钳研究.结果发现HERG及MINK基因3个突变点,心肌肥大中通道下调及交感神经亢进与心肌肥大复合模型中部分通道上调,ICa,L↑, Ikr↑, Iks↑, Ik1↑.普萘洛尔等慢性给药消退心肌肥大的间接作用,使病变通道趋于正常.结论发现二种离子通道病类型及脂质膜及跨膜信息病变是抗心律失常作用的新靶点.
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中国人长QT综合征HERG基因E505D定点突变及其载体构建
目的:对中国人遗传性长QT综合征2型(LQT2)HERG基因突变E505D进行体外定点突变研究,并构建有基因突变E505D的pCMV-seript/HERG的真核表达载体.方法:采用PCR定点突变技术(重叠延伸法),根据突变位置附近的两个单一限制性内切酶位点(BamH I和EcoR I)设计两对引物,将突变位点设计在引物上,通过PCR扩增,使扩增片段上含有所需要的突变位点,后将扩增片段克隆人pCMV-script载体中.结果:DNA测序结果表明,HERG基因在第1515位由G变成T,发生第505位谷氨酸→天冬氨酸的改变(E505D),定点突变成功.结论:PCR技术介导的定点突变准确、高效.pCMV-script/HERG(E505D)的成功构建,为进一步进行该基因突变的功能研究奠定了基础.
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重组质粒pmCherry-WT-hERG和pEGFP-E637K-hERG的构建及其在细胞内的表达和定位
目的 分别构建先天性长QT综合征(LQTS)相关HERG基因和E637K突变基因与红色和绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pmCherry-WT-hERG和pEGFP-E637K-hERG,观察其在细胞内的表达和定位情况.方法 将克隆在pcDNA3上的HERG和E637K片段分别亚克隆到红色荧光蛋白载体pmCherry-C2和绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1上,转染HEK293T细胞,24 h后利用western blot技术和荧光显微镜观察重组质粒蛋白表达和细胞内定位情况.结果 重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误.转染pmCherry-WT-hERG野生型质粒的细胞可以检测到135 kD和155 kD 2条蛋白质条带,而转染pEGFP-E637K-hERG突变型质粒的细胞仅显示1条135 kD蛋白质条带,155 kD处条带缺失.融合蛋白发出的红色和绿色荧光表明,突变型蛋白分布于胞浆中,而野生型蛋白主要位于胞膜上.结论 成功构建了pmCherry-WT-hERG和pEGFP-E637K-hERG不同荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中得到有效表达,为LQTS突变基因的进一步功能研究奠定了基础.
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先天性长 QT 综合征2型 hERG 基因 G604S 突变真核表达载体的构建和表达
目的：构建长QT综合征（ LQTS ）2型hERG 基因G604 S突变的真核表达载体G604 S-hERG-pcDNA3、G604S-hERG-pEGFP。方法：采用重叠延伸PCR 法在pEGM-hERG基础上构建G604S突变体PGEM-hERG-G604S，通过限制性内切酶法和基因重组技术将突变体插入到真核表达载体pcDNA3和pEGFP-C2中并测序验证，用脂质体转染法将G604 S-hERG-pEGFP转染至HEK293细胞并观察其荧光表达。结果：构建的含有突变位点的真核表达载体经DNA测序均成功验证hERG基因1810位点碱基G突变为A，构建的G604 S-hERG-pEGFP在HEK293细胞中成功表达绿色荧光。结论：成功构建hERG基因G604 S h-ERG-pcDNA3和G604 S-hERG-pEGFP表达载体。
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关附庚素对HERG钾通道电流及通道动力学的影响
目的 用膜片钳全细胞记录法评价关附庚素(GFG)对HERG基因表达的快速激活延迟整流钾通道电流(IKr)及通道动力学的影响.方法 使用脂质体介导的瞬时转染法把野生型HERG基因转染人人胚肾细胞(HEK293),采用标准的全细胞膜片钳技术记录IKr通道电流,观察不同浓度(3、12.5、50、200和1 000 μmol/L)的GFG对IKr和通道动力学的作用.结果 GFG对IKr的尾电流(Itail)具有浓度依赖性抑制作用,半数大抑制浓度为17.9μmol/L,Hill常数为0.75.50μmol/L GFG使得刺激电流(Istep)和Itail的大峰值电位前移,呈电压依赖性,但不改变激活电位.50μmol/L GFG对IKr具有时间依赖性阻断效应,时间延长抑制效果增强.50μmol/L GFG使激活曲线左移,半数激活电压从(-2.15±1.94)mV改变为(-9.22±2.43)mV(n=5,P＜0.05),但对曲线的斜率因子k无显著影响;50 μmol/L GFG使得稳态失活曲线左移,半数失活电压从(-56.9±1.2)mV改变为(-64.2±1.5)mV(n=6,P＜0.05),但不影响曲线斜率因子k.50 μmol/L GFG加快通道的失活,在-60 mV以上能加快通道的失活后恢复时间,并可显著减慢通道的去激活时间.结论 GFG对HERG基因表达的IKr通道电流具有浓度、电压和时间依赖性阻断作用,主要是通过结合通道的激活态和失活态发挥抑制效应.
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西沙比利对HERG基因表达的快速激活延迟整流钾通道电流及蛋白的影响
目的 评价西沙比利对转染HERG基因表达的快速激活延迟整流钾电流(IKr)和蛋白的影响,探讨其致心律失常的机制.方法 使用脂质体介导的瞬时转染法把野生型HERG基因转染进人胚肾细胞(HEK293),采用全细胞膜片钳技术评价西沙比利对IKr通道电流和动力学的影响;使用G418筛选出稳定转染HERG的细胞,并用西沙比利进行干预,应用免疫蛋白印迹技术评价药物对蛋白的影响.结果 西沙比利对IKr通道的刺激电流(IHERG)和尾电流(Itail)具有浓度和电压依赖性抑制作用,半数大抑制浓度分别14.5和3.9 nmol/L.西沙比利使IHERG和Itail的大峰值电位前移,但不改变激活电位;使激活曲线左移并加快通道的失活,但不改变通道失活后的恢复时间;西沙比利对转染后的HEK293细胞上的IKr通道蛋白无明显抑制.结论 西沙比利通过作用于通道的失活态抑制HERG钾电流,但不影响HERG通道蛋白的表达.
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HERG基因转染HEK293细胞及其编码通道电流的记录
目的 建立HERG基因在HEK293细胞稳定表达的方法.方法 利用Lipofectamine2000将pCDNA3.0-HERG转染进入HEK293细胞,通过G418筛选阳性克隆细胞系,采用免疫荧光细胞化学方法检测该蛋白的表达,用全细胞膜片钳技术测定HERG基因介导的快速激活延迟整流钾电流(Ikr).结果 免疫荧光细胞化学检测证实转染HEK293细胞中HERG通道蛋白的表达,膜片钳全细胞实验记录到Ikr.结论 该方法有效地将HERG基因转染进入HEK293细胞,并稳定表达HERG通道蛋白及介导Ikr.
关键词： 电生理学 长QT综合征 HERG基因 转染 快速激活延迟整流钾电流 -
HERG基因Y475C突变致2型长QT综合征的机制探讨
目的 研究HERG基因Y475C突变的致病机制.方法 利用 DNA定点突变技术构建Y475C表达载体,脂质体介导法转染人胚胎肾细胞进行表达. 转染后48 h用膜片钳技术记录KCNH2(亦称HERG)通道电流变化情况,明确Y475C突变导致2型长QT综合征的机制.结果 电生理学研究显示与野生型通道电流相比,Y475C突变单独或与等量野生型质粒共转染时电流密度均显著降低,并且通道激活特征,包括V1/2(半激活电压)和K斜率因子也有显著改变.Y475C对通道失活特征无显著影响.结论 Y475C突变通过负显性抑制效应以及通道门控特性的改变导致该基因编码的快速激活延迟整流钾电流显著降低是引起患者QT间期延长的机制.
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细胞外钾对 HERG 基因无义突变L539 fs／47表达的调控
目的：研究持续细胞外钾对野生型HERG与其突变体L539fs／47蛋白表达的影响。方法：用脂质体转染法将野生型HERG（WT）及其突变体HERG-L539fs／47（MT）分别转染HEK293细胞36 h后，0.8、4.3及10 mmol／L的钾干预6 h，流式细胞术检测HERG蛋白表达量；干预12 h用激光共聚焦成像和免疫印迹法进行HERG蛋白定位及表达量检测。结果：用激光共聚焦成像检测发现野生型HERG蛋白主要分布在细胞膜上；而HERG突变体L539fs／47蛋白大部分滞留胞浆；并且HERG蛋白的表达均随细胞外钾浓度升高而增多。流式细胞术结果显示细胞外高钾组荧光增多（ P＜0.01），WT组荧光阳性细胞百分比和荧光强度均高于MT组（ P＜0.05）。免疫印迹显示，不同于野生型HERG 135 kD及155 kD 2个条带，突变体仅60 kD 1个条带，3个条带均受细胞外钾影响（ P＜0.05）。结论：细胞外高钾增强细胞膜上野生型和突变型HERG通道蛋白的稳定性，持续低钾干预时间依赖性地减少HERG通道蛋白的表达。
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HERG基因G572R突变体表达载体的构建及其稳定转染细胞系的建立
目的：构建HERG基因G572R突变体表达载体并建立其稳定转染HEK293的细胞系。方法应用重叠延伸PCR构建HERG-G572R突变体表达载体，经G418筛选稳定转染细胞系，通过Real-Time PCR，Western blot及测序鉴定稳定转染细胞系。结果经序列比对，证明HEK-HERG-G572R突变体表达载体构建成功，Real-Time PCR，Western blot及测序证明稳定转染细胞系构建成功。结论该方法可成功构建的HKE-HERG-G572R细胞株，为药物个体化治疗提供工具。
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先天性长QT综合征相关HERG基因A561V突变体及其真核表达载体的构建及表达
目的 在收集的一个先天性长QT综合征(congenital long QT syndrome, LQTS)家系中发现HERG基因A561V突变,探讨HERG基因A561V突变体及其真核表达载体的构建方法,并观察其在真核细胞中的表达.方法 采用克隆载体快速PCR法构建HERG基因A561V突变体PGEM-HERG-A561V,并应用限制性内切酶法将突变体构建到真核表达载体pcDNA3中,用Superfect转染试剂将野生型pcDNA3-HERG及pcDNA3-HERG-A561V突变体与荧光真核表达载体pRK5-GFP共转染至 HEK293细胞,用细胞免疫荧光化学法检测蛋白质表达.结果 构建的突变体经DNA直接测序示HERG基因cDNA1682位点碱基C变为T,构建的突变体在HEK293细胞中成功表达,其蛋白质位于细胞浆中及细胞膜上,而野生型基因的蛋白质位于细胞膜上.结论 用克隆载体快速PCR法构建并表达了HERG基因A561V突变, 为突变基因的进一步功能研究奠定了基础.
