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MLPA技术用于产前DMD基因诊断的应用探讨
假肥大性肌营养不良症是一种严重的神经肌肉疾病,分为杜氏肌营养不良症(DMD)和贝氏进行性肌营养不良症(BMD),均是由于DMD基因( Xp21.2)突变所致[1].由于本病目前无有效的治疗方法,产前诊断成为控制致病基因传递、防止患儿出生及降低发病率的主要措施.本研究对DMD产前诊断家系中具有高患病风险的2个胎儿,提取其羊水基因组DNA,采用多重连接探针扩增技术(MLPA)进行产前基因诊断的探索.
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全基因组扩增在DMD植入前遗传学诊断中的可行性研究
目的:建立单细胞扩增前引物延伸法及巢式PCR技术,研究该技术在杜氏肌营养不良症植入前遗传学诊断中的可行性.方法:获取单个正常男女淋巴细胞和无杜氏肌营养不良(DMD)家族史的单个卵裂球,15碱基随机引物PEP扩增单细胞全基因组,再以巢式PCR技术检测PEP反应产物中DMD基因外显子8,17,19,44,45,48及Y染色体上的皋丸决定基因SRY.结果:单个淋巴细胞和单个卵裂球的6个DMD外显子扩增成功率分别为97.2%(175/180)和100%(60/60),单个男性淋巴细胞SRY的扩增成功率为100%(15/15),而单个女性淋巴细胞无SRY的扩增(0/15).结论:检测单细胞DMD基因外显子8,17,19,44,45,48和SRY的PEP-巢式PCR技术具有较高扩增成功率和特异性,可望应用于DMD的植入前遗传学诊断的单细胞基因诊断中.
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单细胞五重巢式PCR检测DMD基因
目的:探索建立单细胞多重巢式PCR检测杜氏肌营养不良症(DMD)基因外显子17、19、44、45、48的技术,及应用于植入前遗传学诊断(PGD)的前景.方法:获取正常男性单个淋巴细胞和无DMD家族史的单个胚胎细胞,行DMD基因外显子17、19、44、45、48的五重巢式PCR,分析扩增成功率、假阳性率和假阴性率.结果:20个单个淋巴细胞5个外显子扩增成功率为97%(97/100)、假阳性率为4%(1/25)、假阴性率为0%(0/25),20个单个胚胎细胞5个外显子扩增成功率为80%(80/100)、假阳性率为0%(0/25).结论:本文建立的单细胞DMD基因外显子17、19、44、45、48的五重巢式PCR技术具有较高扩增成功率和特异性,应用于DMD的PGD具有现实的可能性.
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产前诊断除外肌营养不良蛋白基因外显子44移码突变一例
先证者,男,1+岁,临床诊断为杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD).该病发生主要原因是编码肌营养不良蛋白(dystrophin)基因的大片段缺失或突变[1].首先采用多重聚合酶链反应技术针对先证者及其父母的肌营养不良蛋白基因26个外显子(包括3、4、6、8、12、1 3、16、17、19、32、34、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、60、Pm、pb)进行检测,未见上述外显子缺失.进而采用多重连接依赖的探针扩增(multiplex ligation-dependcnt probe amplification,MLPA)法检测肌营养不良蛋白基因79个外显子,均未见缺失或重复.终经全基因测序发现先证者第44号外显子一处移码突变:NM_004006.1:c.6391_6392delCA(p.Gln2131AsnfsX3),而先证者父母的44号外显子同步测序均未见异常,且此突变未见报道.通过寡核苷酸多态性数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)、国际人类基因组单体型图计划(www.hapmap,org)和“华大基因千人基因组计划( www.genomics.cn)”中72个中国人样本的数据分析排除多态可能,同时经PDB数据库(www.pdb.org)蛋白功能预测可能造成膜蛋白结构域的改变,因此考虑此突变为新发或生殖腺嵌合造成的致病突变.
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利用脐带血穿刺标本产前诊断杜氏肌营养不良症一例
孕妇34岁,孕1产0,籍贯上海,家族中其舅舅、弟弟均患杜氏肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy,DMD),于少年期死亡.该孕妇非近亲结婚,孕18周,要求产前诊断,转入我院.孕期无特殊,B超提示胎儿与孕周相符,未见异常.入院后B超引导下行羊膜腔穿刺,诊断胎儿为男性后行胎儿脐带血穿刺,抽取胎儿血化验肌酸磷酸激酶,并按常规方法提取DNA.
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“基因剪刀”有望治疗杜氏肌营养不良
美国杜克大学科研人员使用“基因剪刀”(CRISPR)基因编辑技术治疗了一只患杜氏肌营养不良症的成年实验鼠.这是科研人员首次运用这种技术治疗成年哺乳动物的基因疾病.这种治疗方法也有潜力应用于患杜氏肌营养不良症的人类患者.
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炎症反应与杜氏肌营养不良症发病的相关性研究及临床诊断价值分析
杜氏肌营养不良(DMD)是一种临床上严重的和渐进的 X 染色体隐性遗传性神经肌肉疾病,其病理特征表现为肌纤维变性和中枢神经系统疾病,发病率约为活男婴的3.3/10万[1,2]。杜氏肌营养不良发病患者骨骼肌表现为反复退化和再生,并终导致肌卫星细胞耗竭,骨骼肌被结缔组织和脂肪组织代替[3,4]。患者临床上主要表现为全身骨骼肌萎缩,进行性无力和小腿腓肠肌假性肥大,并伴随不同程度的智力障碍,多于20岁左右并发心、肺功能衰竭死亡[5,6]。因此,产前诊断、母体筛查及早期诊断具有重要的临床和实践意义。本研究分析炎症反应与杜氏肌营养不良症发病的相关性及其临床诊断价值,为临床诊断与治疗提供参考。
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2016年9月FDA批准新药概况
2016年9月,FDA批出1个新分子实体药品,为Sarepta公司治疗杜氏肌营养不良症药物Exondys 51(eteplirsen)。
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用于囊性纤维化和肌营养不良的药物Ataluren
体内合成的囊性纤维变性膜透性调节蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)和抗肌营养不良蛋白结构不完整和功能异常所引起的囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)和杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)均是遗传性疾病,病因是患者的相关基因发生无义突变(即单个核苷酸发生突变),导致mRNA转录过程中的终止密码子(UAA、UAG和UGA)提前产生,从而使合成的相关蛋白质分子短小,且功能丧失.
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常染色体隐性遗传的类杜氏肌营养不良症的初步分析
近年来,我们在近百例DMD(杜氏肌营养不良症)的基因分析诊断中,出现4例可能是DMDA(常染色体隐性遗传肌营养不良症,类杜氏肌营养不良症,Duchenne-like muscular dystrophy),其中女性2例,男性2例.现将其中1例女性DMDA的DNA分析及抗肌营养不良蛋白(Dystrophin)mRNA转录及其蛋白质印迹分析报导如下.
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合并严重肺功能障碍的重度杜氏肌营养不良症型脊柱侧凸的手术治疗
杜氏肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy,DMD)是肌营养不良症中觉见的一种,它往往合并有严重的脊柱侧凸畸形,且畸形进展较特发性脊柱侧凸更为常见和迅速.对于同时合并有严重的肺功能障碍(定义为用力肺活量(forced vital capacity,FVC)小于预测值的30%)的病例,矫形外科医生往往面临两难的局面:一方面侧凸矫形手术对DMD患者十分重要;另一方面又十分担心术后呼吸系统并发症发生;既往文献对手术安全性及肺功能改善情况报道较少,日本北里大学的学者M.Takaso等人报道其成功治疗14例此类患者的经验.
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二代测序技术在杜氏肌营养不良症家系中的分子诊断应用
对22例临床拟诊断为杜氏肌营养不良症(DMD)患儿的家系临床资料进行分析,探讨二代测序(NGS)技术在DMD患者分子诊断中的临床应用价值.先证者同时送检遗传性神经肌肉病相关panel行NGS检测和Dystrophin基因多重连接探针扩增术(MLPA)检测,分析两种方法检出的Dystrophin基因外显子缺失/重复突变结果,Dystrophin基因点突变经Sanger测序验证.通过NGS测序,22例先证者均检出Dystrophin基因突变,其中外显子缺失/重复型突变14例,点突变及微小变异8例.MLPA检测结果与NGS检测结果一致.Sanger测序结果显示NGS检测出的点突变及微小变异是正确的.1例错义突变c.6290G>T,1例无义突变c.3487C>T,4例微小缺失导致的移码突变c.1208delG、c.7497_7506delGGTGGGTGAC、c.9421_9422delAA、c.8910_8913delTCTC在人类基因突变数据库中均未见报道,为Dystrophin基因新突变.该研究结果显示NGS技术可全面检测Dystrophin基因外显子缺失/重复、点突变、微小缺失和内含子突变等变异,在DMD患者分子诊断中的临床应用有一定价值,值得推广.
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杜氏肌营养不良症(DMD)的植入前遗传学诊断
目的 对杜氏肌营养不良症(ducherule muscular dystrophy,DMD)进行植入前遗传学诊断(preim-plantafton genetic diagnosis,PGD),阻断DMD患儿的出生.方法 针对患者的DMD基因的48号外显子缺失位点采用巢式PCR分别对患者和携带者的单个淋巴细胞、行体外授精一胚胎移植治疗的健康志愿捐献者的单个卵裂球细胞进行扩增,建立稳定的经单细胞基因诊断DMD的方法 .再对在该中心进行超排和体外授精一胚胎移植治疗的DMD携带者的胚胎活检后完成PGD,根据诊断结果 选择健康的优质的胚胎移植入子宫.结果 携带者的单个淋巴细胞的PCR扩增成功率为90.5%(95/105),健康志愿捐献者的单个卵裂球细胞PCR扩增成功率为85.7%(54/63),假阳性率为0(0/28).分别对3例DMD携带者施行了植入前遗传学诊断,病例1移植了2枚未受累的优质胚胎,且成功妊娠单胎并已于2005年4月分娩了1个健康的女婴;病例2移植了2枚优良胚胎,不幸的是未能妊娠.病例3诊断为未受累的仅有的2枚胚胎因胚胎质量差而未能移植.结论 该组采用的方案可对DMD基因的48号外显子缺失突变的DMD家庭进行PGD,达到了阻断DMD惠儿出生的目的 .
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杜氏肌营养不良症的细胞治疗进展
杜氏肌营养不良症(DMD)为X-连锁隐性遗传,患病率为3.3/10万.本病发生是编码抗肌萎缩蛋白(Dystrophin,Dys)的基因突变引起.DMD患者骨骼肌呈反复退化和再生,终肌卫星细胞耗竭,骨骼肌被结缔组织和脂肪代替.患者往往在20岁左右因呼吸衰竭而死亡.目前DMD临床治疗效果仍不理想,本文就DMD细胞治疗实验及临床研究进行综述.
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MLPA联合遗传连锁分析在假肥大型肌营养不良症产前诊断中的价值
目的 探讨多重连接依赖探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)联合短串联重复序列(short tandem repeat,STR)基因连锁分析用于Duchenne型假肥大型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)产前诊断的价值.方法 通过检测Y染色体性别决定基因(Y chromosome sex-determining gene,SR Y)判断胎儿性别;MLPA检测45个DMD家系中先证者、孕妇以及胎儿Dystrophin基因突变情况,并对家系成员和胎儿进行第45、49、50内含子以及5′和3 ′端STR的连锁分析.结果 45个进行产前诊断的家系中,SRY阳性31例,其中6例为DMD患病胎儿;阴性14例,其中4例为携带者,余未见异常.结论 MLPA能检测胎儿Dystrophin基因外显子突变情况,STR连锁能分析胎儿是否继承母源性风险X染色体,因此,STR连锁分析能发现MLPA技术检测不到的外显子突变胎儿.将两种方法结合起来用于DMD的产前诊断准确性更高.
关键词: 多重连接依赖探针扩增 短串联重复序列 连锁分析 杜氏肌营养不良症 产前诊断 -
八个杜氏肌营养不良症家系的基因检测及产前诊断
目的 探讨杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)患者家系致病基因突变的检测及产前诊断方法.方法 联合采用变性高效液相色谱、多重PCR、PCR测序和其它分子生物学技术,对8个家系中杜氏肌营养不良症患者进行诊断,对女性亲属进行携带者筛查,进行遗传咨询和产前诊断.结果 8例诊断为DMD的患者中,4例为大片段缺失,3例为点突变,患者中6例为新生突变.对5个家系进行产前诊断,抽取羊水或者绒毛组织进行检测,结果显示胎儿均正常,抽取脐带血复查肌酸激酶值,出生后进行临床鉴定,与产前诊断结论一致.结论 联合应用短串联重复序列分析、变性高效液相色谱技术、多重PCR技术和基因测序技术,可以提高DMD基因检测的准确率,为DMD家系成员的遗传咨询和产前基因诊断提供准确的依据,避免患病胎儿的出生.
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杜氏肌营养不良症的无创性产前基因诊断研究
目的探讨杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)的无创性产前基因诊断的可行性。方法用不连续密度梯度离心方法初步富集妊娠9~21周孕妇外周血中的有核红细胞,细胞涂片离心机制片,瑞氏姬姆萨染色标记,显微操作仪获取单个有核红细胞,改良的PEP(primer extension preamplification)方法扩增单个有核红细胞的全基因组DNA;在综合性别和DMD基因内的数个STR位点连锁分析进行DMD基因诊断的同时,鉴定单个有核红细胞的来源,再应用荧光标记聚合酶链反应扩增9个微卫星片段,进行基因型分析,进一步判定单个有核红细胞来源。结果成功诊断了1例DMD男性患病胎儿。结论初步建立了DMD的无创性产前基因诊断的方法。
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中国西南地区170例杜氏/贝氏肌营养不良症dystrophin基因变异谱分析
目的 构建中国西南地区杜氏/贝氏肌营养不良症(DMD/BMD) dystrophin基因变异谱,探讨dystrophin基因型与临床表型之间的关系.方法 采用多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)对170例DMD/BMD患者进行dystrophin基因分析,其中3例怀疑点突变患者采用Sanger 测序分析基因突变位点.结果 Dystrophin基因突变MLPA检出率为72.94%,其中基因缺失、重复及点突变所占比例分别为62.35% (106/170),8.82% (15/170)及1.76% (3/170).共发现64种不同类型突变,连续外显子44~55缺失突变型占全部缺失型患者的75.47%.大部分5'端断裂点集中在2个热区(主热区:内含子43~55;次热区:内含子1~20).基因型-表型分析显示DMD/BMD严重程度与基因缺失型或重复型无关,而与改变开放阅读框架型突变有关(r=0.640,P<0.001).结论 连续外显子缺失或重复是dystrophin基因突变的主要类型,DMD/BMD严重程度与其改变开放阅读框架型突变有关.
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女性杜氏肌营养不良症1例并文献复习
目的:研究女性杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)患者的临床特征,探讨其可能的发病机理.方法:对1例具有典型DMD症状和体征的18岁女性患者进行血清肌酶、心电图、肌电图和染色体检查.结果:该患者血清肌酶显著增高,肌电图为肌源性损害表现,核型分析正常.结论:该患者具有典型的DMD临床表现,核型分析正常,考虑XP21/常染色体易位或单亲二倍体是其可能的机理,需作进一步研究.
关键词: 杜氏肌营养不良症 女性 抗肌萎缩蛋白 XP21/常染色体易位 单亲二倍体 -
杜氏肌营养不良症生物学治疗的研究进展
杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是由于dystrophy基因突变所致的一种致死性X连锁隐性遗传病.随着糖皮质激素(glucocorticoids,GCs)的广泛应用,多学科综合护理水平的提高,心脏和呼吸系统并发症的处理,DMD患者的生存质量得到明显提高,生存时间亦得以延长.近年来,随着对包括产前治疗性干预在内的一系列治疗途径的研究及临床应用,进一步降低了患者的发病率和病死率.本文对DMD生物学治疗的研究现状进行综述,并分析不同治疗策略在其治疗中的研究进展和潜力.