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DMD基因突变及突变检测技术研究进展
假性肥大型进行性肌营养不良(DMD/BMD)是一类发病率较高的X连锁隐性遗传病.DMD基因庞大,突变机制复杂,随着分子生物学的进展,对DMD基因及其所编码dystrophin蛋白的认识不断深入,探索更简便、准确、经济的基因突变检测技术成为目前对DMD研究的热点,本文着重对DMD基因、突变与表型关系的研究进展,以及突变检测技术的进展做一综述.
关键词： DMD dystrophin蛋白 基因突变 基因诊断 -
一例假肥大型肌营养不良症患儿基因新突变报道和临床分析
目的 对一例假肥大型肌营养不良(DMD/BMD)患儿发生的DMD 基因突变(c.9760_9781dup22/p.Pro3261LeufsX5)进行报道,并对其临床表现进行分析.方法 联合应用多重连接探针扩增技术(MLPA)和基因测序技术的方法,对DMD 患儿进行DMD 基因分析.结果 MLPA 技术检测到患儿DMD 基因67 号外显子发生缺失突变,通过PCR 技术、基因测序技术检测,证实患儿发生的是67 号外显子的微小突变(c.9760_9781dup22/p.Pro3261LeufsX5).结论 67 号外显子的微小突变(c.9760_9781dup22/p.Pro3261LeufsX5)是一种新突变,此突变可能与DMD 疾病发生及智力障碍表现相关.
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杜(氏)进行性肌营养不良和脊髓性肌萎缩的基因诊断和产前诊断
杜(氏)进行性肌营养不良(DMD)和脊髓性肌萎缩(SMA)是常见的两种累及肌肉的遗传病,以基因片段缺失为主要突变类型.联合应用各种基因分析手段可准确地进行基因诊断和杂合子检测.在产前诊断中,应采用两种不同技术路线进行分析以避免样品污染造成差错.DMD散发病例的母亲可能是生殖腺嵌合甚至就是携带者,应一律进行产前诊断.
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Duchenne型肌营养不良分子发病机制及基因治疗新进展
Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是常见的肌营养不良类型,遗传方式为X染色体连锁隐性遗传.国外流行病学调查显示,发病率约为每3500至6000名活产男婴有1例发病[1-3].
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外显子跳跃剪接法治疗Duchenne型肌营养不良的机制研究进展
Duchenne型肌营养不良(DMD)是常见及严重的儿童肌萎缩疾病,发病率为初生存活男婴的1/3500,通常在3～5岁隐袭起病,肌肉萎缩及无力进行性加重,多于12岁丧失行走能力,需依靠轮椅,多数患者在25～30岁即因呼吸道感染、心力衰竭而死亡.
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运用多重连接探针检测DMD
目的 杜氏肌营养不良是是由于抗肌萎缩蛋白的缺失、重复及点突变所致的一种X-连锁隐性遗传性神经肌肉病.目前运用多重PCR检测此基因热点区可以检测大部分病人的缺失突变,然而多重PCR不能检测非热点区及重复突变,且不能定量分析拷贝数.运用多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)检测DMD可为临床诊断及产前诊断提供依据.方法 本实验采用的多重连接探针扩增(MLPA)能快速、准确、半定量地分析患者及携带者缺失与重复突变的拷贝数,且检测范围涉及整个基因.结果 15例DMD患者9例是由于缺失突变所致,6例未检测到缺失突变及重复突变.其中7例缺失突变病人经"一步到位法"多重PCR验证,2例缺失突变病人经多重PCR未检测到的缺失突变.结论 MLPA是一种快速、准确、简便检测缺失及重复突变的方法.利用MLPA能检测所有DMD患者及携带者的缺失和重复突变.
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杜氏/贝氏肌营养不良症433个家系的基因突变分析
目的 对无亲缘关系的杜氏/贝氏肌营养不良症(DMD/BMD)家系进行DMD基因突变分析,探讨DMD基因突变特点,并主要阐明DMD基因点突变在中国汉族人群中的分布模式.方法 在2010年3月至2014年12月郑州大学第一附属医院收集的433个无亲缘关系的中国汉族DMD/BMD家系中,首先应用多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术对DMD/BMD家系进行DMD基因79个外显子进行缺失或重复的分析;应用PCR扩增技术针对MLPA单个外显子缺失的样本排除MLPA假阳性;对应用MLPA技术已排除DMD基因大片段缺失和重复的117个家系中的先证者,应用二代测序(NGS)技术对DMD基因79个外显子进行点突变分析,应用Sanger测序对点突变进一步验证.结果 在433个无亲缘关系的中国汉族DMD/BMD家系中,应用MLPA技术在316个家系中检测到DMD基因存在外显子大片段缺失和重复突变;其中MLPA检测的57单个外显子缺失样本,应用PCR扩增技术和Sanger测序发现3个新的点突变包括:2个无义突变c.1729G ＞T[p.Glu577X]、c.3346A＞T[p.Lys1 116X]和1个移码突变c.8605_8606delGT[p.Val2869ThrfsX25].应用NGS(Ion PGM高通量平台)和Sanger测序在117个MLPA阴性结果家系对DMD基因进行直接测序,在96个家系中检测到DMD基因92个不同点突变,包括46个新突变、42个已知致病突变和4个可疑多态位点(rs189143447、rs202008454、rs200213555、rs187617705).46个新突变包括16个无义突变(c.100A＞T[p.Lys34X]、c.1201C＞T[p.Gln401X]、c.1707C＞A[p.Cys569X]、c.1831G＞ T[p.Glu611X]、c.1912C＞ T[p.Gln638X]、c.2213C＞G[p.Ser738X]、c.3673_3673delA[p.Ile1225X]、c.3774C＞A[p.Cys1258X]、c.4858G ＞T[p.Glu1620X]、c.5764A ＞T [p.Lys1922X]、c.6035T＞G[p.Leu2012X]、c.6408G＞A[p.Trp2136X]、c.7717C ＞T [p.Gln2573X]、c.7864G ＞T[p.Glu2622X]、c.8184_8185insT[p.Lys2729X]、c.8215C＞T[p.Gln2739X]),5个错义突变(c.139G＞A[p.Gly47Arg]、c.238G＞C[p.Ala80Pro]、c.335G ＞T[p.Trp112Leu]、c.804A ＞C [p.Leu268Phe]、c.1149G ＞T [p.Glu383Asp]),6个剪切位点突变(c.2293-3C＞A、c.2380+ 1G＞T、c.3277-1G＞C、c.4519-7A＞G、c.5740-15G＞T、c.7661-1G＞C),16个缺失突变(c.688_688delA[p.Met230CysfsX14]、c.1760_1791del32[p.Thr587IlefsX37] 、c.2271_2271delA [p.Asp774ThrfsX22] 、c.2281_2285delGAAAA[p.Glu761SerfsX10]、c.2527_2527delG[p.Glu843SerfsX3]、c.3405_3405delC[p.Asn1135LysfsX18]、c.4450_4450delC[p.His1484ThrfsX14]、c.4770_4770delA[p.Thr1590ThrfsX5]、c.4937 _4937delA[p.Glu1646GlyfsX11] 、c.5253_5256delATTA [p.Lys1751LysfsX2] 、c.5654_5654delA [p.Gln1885ArgfsX6]、c.7441_7441delG[p.Glu2481AsnfsX13]、c.7860_7860delC[p.Ile2620IlefsX18]、c.8668-8668delG/c.8668+ 1-8668+1delG、c.9009_9009delC[p.Thr3003ThrfsX18]、c.9021_9021delT [p.Ile3007IlefsX14])和3个插入突变(c.305_306insG[p.Gly102GlyfsX4]、c.3116_3117insA [p.His1039GlufsX11]、c.9197_9198insATCTC[p.Ser3066SerfsX25]).87.4％ (83/95)点突变破坏了阅读框(46个无义突变、24个移码突变、13个剪切突变).结论 结合应用MLPA技术、NGS技术、Sanger测序可为患者提供经济高效的基因诊断服务.研究发现的点突变多数是可预测的提前终止密码子或导致剪接缺陷,导致肌营养不良蛋白功能缺陷.
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克隆外显子探针反向斑点杂交检测DMD基因缺失
目的:制备检测DMD基因常见易缺失外显子的核苷酸探针,通过反向斑点杂交试验验证其特异性,为初步研制DMD基因诊断芯片作准备.方法:从健康人外周静脉血白细胞提取基因组DNA,应用经典18对引物对DMD基因常见易缺失外显子进行PCR扩增.将扩增产物与pGEM@-T Easy载体连接,转化E.coli JM109感受态细胞.克隆目的片段,并作测序鉴定.以此为探针进行反向斑点杂交试验.结果:序列分析表明,克隆片段代表DMD基因18个常见易缺失外显子;以这些片段为探针进行反向斑点杂交,其结果与PCR相符.结论:克隆的基因片段用作探针在反向斑点杂交试验中显示出较好的特异性,可用于DMD基因常见缺失的检测.
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假性肥大型进行性肌营养不良症
假性肥大型进行性肌营养不良症( DMD),由Duchenne (1868年)首先描述,绝大多数发生于男孩,通常在儿童期发病.女性仅为异性染色体携带者.首发症状常以骨盆带肌肉无力、肌张力低、走路缓慢、易跌.由于髂腰肌和股四头肌无力而使患孩站立登楼困难.背部伸肌无力则站立时腰椎过度前凸,臀中肌无力则行走时骨盆向两侧摆动,呈典型的鸭行步态.患儿仰卧位站起时,先翻转为俯卧位,再用双手支持床面及下肢才能缓慢站起.由于肩胛带肌及前锯肌无力,可呈现游离肩与翼状肩胛.约90％的患儿有肌肉的假性肥大,以腓肠肌明显.大多数患儿还伴有心肌损害,心电图异常.假性肥大型病情重,预后不良.
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DMD启动子在基因治疗中作用的研究进展
假肥大型进行性肌营养不良(DMD)是一类X连锁隐性退行性肌肉萎缩病.目前,关于DMD基因外显子缺失,内含子断裂点以及所编码dystmphin蛋白的结构已经明确,这对DMD的临床诊断有很大价值;但对于基凶治疗来说,明确DMD基因启动子的顺式元件以及反式因子的结构及相互作用关系是十分重要的,这些元件的相互作用对于dystrophin蛋白的转录水平及表达起关键的调节作用;研究表明,人工合成的DMD肌启动子活性比生物体内DMD基因启动子活性高,找出启动子关键元件构建特异性高效启动子,将其应用于基因治疗,这是一条新的途径.
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DMD基因突变检测技术的回顾与展望
DMD是一类发病率较高的X连锁隐性遗传病.DMD基因突变机制复杂,探索更直接、简便、准确的基因突变检测技术是目前对DMD研究的热点.随着分子生物学的发展,DMD基因诊断技术取得了一定的进展,本文探讨了各项技术的优势与缺陷,并展望了生物芯片等新技术的应用前景.
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杜氏型肌营养不良症心肌损害的研究进展
杜氏型肌营养不良(DMD)是肌营养不良中症状重、进展快的一个类型,因抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)基因缺陷,使肌肉组织缺乏抗肌萎缩蛋白,引起肌肉进行性变性、坏死.DMD是性连锁隐性遗传病,男性儿童早期发病,表现为进行性四肢无力,肌肉萎缩,合并腓肠肌肥大,晚期四肢瘫痪.可累及心肌、呼吸肌,造成心力衰竭和呼吸衰竭,严重影响患者的生活质量,是疾病晚期致死主要原因[1-3].近年来由于非创伤性机械通气医疗技术的发展和应用,降低了因呼吸衰竭而导致DMD患者死亡的风险[4 ],使心肌损害的危害越来越突出.现将近年来DMD心肌损害相关研究进展综述如下.
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DMD的产前基因诊断小结
DMD(假性肥大型进行性肌营养不良症)是具严重危害的X染色体连锁隐性遗传病,男性活产婴儿的发病率为1/3 500,一般3～6岁发病,进行性加重,12岁左右即不能行走,约20岁夭折,无有效治疗方法,其防治的基本措施是对DMD高危孕妇进行胎儿产前基因诊断,不让有病患儿出生.
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合并严重肺功能障碍的重度杜氏肌营养不良症型脊柱侧凸的手术治疗
杜氏肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy,DMD)是肌营养不良症中觉见的一种,它往往合并有严重的脊柱侧凸畸形,且畸形进展较特发性脊柱侧凸更为常见和迅速.对于同时合并有严重的肺功能障碍(定义为用力肺活量(forced vital capacity,FVC)小于预测值的30%)的病例,矫形外科医生往往面临两难的局面:一方面侧凸矫形手术对DMD患者十分重要;另一方面又十分担心术后呼吸系统并发症发生;既往文献对手术安全性及肺功能改善情况报道较少,日本北里大学的学者M.Takaso等人报道其成功治疗14例此类患者的经验.
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Duchenne肌营养不良症的分子遗传学及基因治疗研究进展
Duchenne肌营养不良症(DMD)是致死性神经肌肉系统X连锁隐性遗传病,是人类肌营养不良症中常见和严重的类型.
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假肥大型肌营养不良15例临床分析
2002年1月～2007年3月,我们共收治假肥大型肌营养不良(DMD)患儿15例.现分析如下.
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血清MMP-9与DMD骨骼肌纤维化的相关性分析
目的：探讨血清MMP‐9与DMD骨骼肌纤维化的关系。方法收集DMD、BMD患者腓肠肌组织和非抗凝血以及正常儿童非抗凝血，对腓肠肌肌组织行 HE染色观察骨骼肌基本病理改变，Masson染色观察骨骼肌纤维化程度，进行免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶连结（SP）法观察MMP‐9在肌肉组织中的分布情况。非抗凝血行 ELISA法进行血清MMP‐9、TIMP‐1、TGF‐β1浓度测定，并将DMD组按病情分为＜5岁、5～9岁组、＞9岁组。结果 DMD组纤维化程度比BMD组高（P＜0.05）；在DMD患者中，＜5岁组、5～9岁组、＞9岁组间纤维化程度差异均有统计学意义（P＜0.05），且纤维化程度与患儿年龄成正相关（r＝0.694，P＜0.05）；MMP‐9存在于DMD骨骼肌中，且在巨噬细胞浸润的部位表达增强；在DMD患者中，＜5岁组、＞9岁组与＜5岁组相比，血清MMP‐9浓度降低（P＜0.05），5～9岁组与＞9岁组相比，血清MMP‐9浓度差异无统计学意义（P＞0.05）；9岁前的DMD患者，血清MMP‐9浓度与年龄成正相关（r＝0.6118，P＜0.05）。结论血清MMP‐9浓度在一定程度上反映了DMD病情变化，可作为评估DMD病情变化及DMD早期治疗效果的指标。
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Duchenne型肌营养不良症的治疗进展
Duchenne型肌营养不良症目前的治疗包括基因治疗、成肌细胞移植治疗、骨髓细胞移植治疗等方法,本文总结了近年来上述方法的研究进展和各自优缺点,并指出今后研究方向.
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第一届中国假肥大型肌营养不良症转化医学研讨会会议纪要
由广东省中西医结合学会、欧洲神经肌肉病治疗协会( TREAT-NMD)、中山大学和天津医科大学主办的“第一届中国假肥大型肌营养不良症转化医学研讨会”于201 1年4月7日至201 1年4月9日在广东省广州市召开,英国纽卡斯尔大学的Volker Straub教授和广东省中西医结合学会神经科专业委员会主任委员、中山大学附属第一医院张成教授担任大会主席.来自美国、英国、加拿大、荷兰、澳大利亚、瑞典、瑞士和中国的Duchenne型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)专家、65个中国DMD家庭和2个美国DMD家庭共200多人参加了本次会议.
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杜氏肌营养不良症的细胞治疗进展
杜氏肌营养不良症(DMD)为X-连锁隐性遗传,患病率为3.3/10万.本病发生是编码抗肌萎缩蛋白(Dystrophin,Dys)的基因突变引起.DMD患者骨骼肌呈反复退化和再生,终肌卫星细胞耗竭,骨骼肌被结缔组织和脂肪代替.患者往往在20岁左右因呼吸衰竭而死亡.目前DMD临床治疗效果仍不理想,本文就DMD细胞治疗实验及临床研究进行综述.
