产前诊断除外肌营养不良蛋白基因外显子44移码突变一例

先证者,男,1+岁,临床诊断为杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD).该病发生主要原因是编码肌营养不良蛋白(dystrophin)基因的大片段缺失或突变[1].首先采用多重聚合酶链反应技术针对先证者及其父母的肌营养不良蛋白基因26个外显子(包括3、4、6、8、12、1 3、16、17、19、32、34、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、60、Pm、pb)进行检测,未见上述外显子缺失.进而采用多重连接依赖的探针扩增(multiplex ligation-dependcnt probe amplification,MLPA)法检测肌营养不良蛋白基因79个外显子,均未见缺失或重复.终经全基因测序发现先证者第44号外显子一处移码突变:NM_004006.1:c.6391_6392delCA(p.Gln2131AsnfsX3),而先证者父母的44号外显子同步测序均未见异常,且此突变未见报道.通过寡核苷酸多态性数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)、国际人类基因组单体型图计划(www.hapmap,org)和“华大基因千人基因组计划( www.genomics.cn)”中72个中国人样本的数据分析排除多态可能,同时经PDB数据库(www.pdb.org)蛋白功能预测可能造成膜蛋白结构域的改变,因此考虑此突变为新发或生殖腺嵌合造成的致病突变.

Turner综合征合并抗肌萎缩蛋白病的临床表现及病理学改变

目的 探讨Turner综合征合并抗肌萎缩蛋白病(dystrophinopathy)的临床表现、病理学特点.方法 开放式骨骼肌活检,组化染色、免疫组化染色,病理分析.结果 HE染色显示中度肌萎缩,萎缩肌纤维多呈圆形,偶见坏死肌纤维,散在不透明纤维,肌间结缔组织轻度增生.抗Dystrophin-N,-C,-R 单克隆抗体染色肌纤维膜淡染.结论 此文报道的患者可能为携带dystrophin缺陷基因的Turner综合征患者,因其缺少1条正常X染色体的补偿作用而出现抗肌萎缩蛋白病表现.

Due to their relative abundance, stable biological properties and excellent reproductive activity,umbilical cord mesenchymal stem cells have previously been utilized for the treatment of Duchenne muscular dystrophy, which is a muscular atrophy disease. Three patients who were clinically and pathologically diagnosed with Duchenne muscular dystrophy were transplanted with umbilical cord mesenchymal stem cells by intravenous infusion, in combination with multi-point intramuscular injection. They were followed up for 12 months after cell transplantation. Results showed that clinical symptoms significantly improved, daily living activity and muscle strength were enhanced,the sero-enzyme, electromyogram, and MRI scans showed improvement, and dystrophin was expressed in the muscle cell membrane. Hematoxylin-eosin staining of a muscle biopsy revealed that muscle fibers were well arranged, fibrous degeneration was alleviated, and fat infiltration was improved. These pieces of evidence suggest that umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation can be considered as a new regimen for Duchenne muscular dystrophy.

mdx小鼠骨骼肌组织成肌、成脂、成骨基因的特异性表达

背景:干细胞移植是治疗肌营养不良症的有效方法之一,但移植的干细胞在病理骨骼肌中成肌表达较低.目的:通过比较mdx 小鼠和C57 小鼠的骨骼肌形态及成肌、成脂、成骨基因表达的差异,探讨mdx 小鼠骨骼肌病理改变的可能机制.方法:取mdx 小鼠与C57 小鼠的骨骼肌组织行冰冻切片,苏木精-伊红染色和Vonkossa染色观察两种小鼠肌肉组织的形态特征;提取mdx 小鼠和C57 小鼠骨骼肌组织总RNA,real-time PCR 检测成肌、成脂、成骨相关基因的表达.结果与结论:mdx 小鼠骨骼肌有肌纤维坏死和再生,伴有轻度脂肪、纤维结缔组织增生,Vonkossa 染色可见钙结节沉积,而C57 小鼠的骨骼肌细胞形态清晰,核位于细胞周边.与C57 小鼠比较,mdx 小鼠肌肉组织成骨、成脂基因表达有不同程度的上调(P < 0.05),而成肌基因表达下调(P < 0.05).dystrophin 基因缺失及成肌基因表达下调、成骨和成脂基因上调是造成mdx 小鼠肌肉组织变性坏死的原因.

尾吊影响大鼠比目鱼肌Dystrophin表达分布以及血清乳酸脱氢酶活性

背景:抗肌萎缩蛋白Dystrophin 在肌肉运动性损伤时易发生改变.目的:观察模拟失重效应对大鼠比目鱼肌抗肌萎缩蛋白Dystrophin 表达、分布及血清乳酸脱氢酶活性的影响.方法:采用大鼠后肢尾吊模拟失重效应模型,分别在尾吊1,4,7,10,14 d 分离SD 大鼠比目鱼肌并提取血清进行检测.结果与结论:随着尾吊时间的延长,大鼠肌纤维横截面积减小;肌膜上Dystrophin 呈现弥散性分布的趋势,甚至出现Dystrophin 断裂现象;Dystrophin mRNA 表达下降.同时尾吊7 d,大鼠血清乳酸脱氢酶活性升高.提示失重引起的肌萎缩,伴随着Dystrophin mRNA 的表达下降和蛋白分布弥散性变化,而乳酸脱氢酶活性变化提示失重性肌萎缩可能与肌损伤的发生有关.

计算机三维重构验证Dystrophin疏水区段与Duchenne型肌营养不良的发病

背景：Duchenne型肌营养不良和Becker型进行性肌营养不良都是dystrophin基因突变所致，但后者临床表型较轻。“阅读框规则”可解释大部分基因型与临床型关系，但累及疏水区段的整码突变也可导致Duchenne型肌营养不良。因此很有必要了解疏水区域在dystrophin中的功能，且这些疏水区段的三维结构及功能在发病机制中所起的具体作用仍未阐明。
　　目的：通过Kyte&Doolittle平均疏水轮廓分析研究 dystrophin 的疏水区段。利用swiss-model三维重构dystrophin的疏水区段阐述其在发病机制中所起的作用。
　　方法：参考莱顿开放数据库(http：//www.dmd.nl/)及收集中山大学附属第一医院2002年至2013年确诊Duchenne 型进行性肌营养不良或Becker 型进行性肌营养不良的缺失型整码突变患者资料共1038例，分析其临床型与基因型关系。使用 bioedit 软件计算dystrophin 的平均疏水轮廓及利用swiss-model 三维重构疏水区段，结合临床型和基因型关系确定dystrophin重要功能区。
　　结果与结论：dystrophin存在4个疏水区段，分别为肌动蛋白结合区内的Calponin同源区2、中央棒区内的重复区16、第三铰链区和EF手型区。第1，2，4疏水区段是 dystrophin 糖蛋白复合物中dystrophin与其他糖蛋白的结合区域，其破坏严重影响dystrophin糖蛋白复合物功能，临床症状重。中央棒区在第三铰链区附近断裂后，HⅢ的无规则卷结构不容易与断端重复区的螺旋结构恢复连接。但第三铰链区同时缺失，其两端的重复区较容易重新连接，所以第3疏水区破坏后其临床症状反而较轻。提示dystrophin的疏水区段是其重要功能区，多是dystrophin糖蛋白复合物中dystrophin与相关蛋白的结合部位，在Duchenne型肌营养不良的发病机制中起重要作用。

肌特异性miRNA在肌细胞分化过程及肌营养不良中的表达

目的:观察肌特异性miRNA(miR-1,-133a和-206)在肌细胞增殖和分化过程中的变化,探讨肌特异性miRNA与肌营养不良的关系.方法:培养小鼠成肌细胞C2C12并诱导分化成熟,应用实时荧光定量PCR(q-PCR)分别检测C2 C12在增殖期和分化期(1、3、5 d)miR-1、-133a、-206的变化;免疫组织化学法筛选dystrophin缺失型营养不良病例(DMD),q-PCR检测miR-1、-133a、-206在DMD肌组织中的表达情况.结果:增殖期C2C12细胞的miR-1、-133a、-206表达量较低,分化期3者表达均升高,并随着成肌细胞分化时间的延长,miRNAs表达显著升高,其中miR-1表达升高明显;筛选的10例DMD标本均存在不同程度的dystrophin蛋白表达减弱或缺失,与非特异性改变肌组织对比,miR-1、-133a、-206表达均升高,其中miR-206在DMD患者肌组织的表达水平显著升高.结论:miR-1、-133a、-206均能促进成肌细胞的分化,其中miR-206在肌营养不良的病变过程中可能发挥重要作用.

以晕厥发病的成年Becker型肌营养不良症1例报道

Becker型肌营养不良症(Becker muscular dystrophy, BMD)是由抗肌萎缩蛋白(Dystrophin蛋白)缺陷导致的缓慢进展的肌肉萎缩、无力伴假性肌肥大为特征的遗传性肌肉疾病.传统上,BMD多在5～10岁起病,至20～25岁丧失独立行走能力,存活至40岁左右[1].随着对Dystrophin蛋白基因的研究深入,已发现一些30岁以后发病或早期以心肌损害为主要表现的BMD[2,3].本文报道1例以心肌损害导致晕厥而首发的成年起病的BMD.

无症状/轻症状高肌酸激酶血症20例临床研究

目的 明确无症状/轻症状高肌酸激酶血症的病因及肌肉病理的诊断价值.方法 对20例无症状/轻症状高肌酸激酶血症患者行肌肉病理检测,部分病例进一步行酶学和基因检测.结果 纳入的20例患者中,病理异常17例(85.0％),提示诊断11例(55.0％):dysferlin相关肌病6例,dystrophin相关肌病4例,Pompe病1例;另3例分别确诊为calpain相关肌病、炎性肌病及药物相关肌病.共14例(70.0％)获得确诊.肌酸激酶＜2 000 U·L-1、2 000～10 000 U·L-1和＞10 000 U·L-1患者中分别确诊2/4例(50.0％)、9/13例(69.2％)和3/3例(100.0％).结论 肌肉活检对无症状/轻症状高肌酸激酶血症患者的诊断有重要价值;肌酸激酶水平与确诊率有一定关联.

杜氏型肌营养不良症心肌损害的研究进展

杜氏型肌营养不良(DMD)是肌营养不良中症状重、进展快的一个类型,因抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)基因缺陷,使肌肉组织缺乏抗肌萎缩蛋白,引起肌肉进行性变性、坏死.DMD是性连锁隐性遗传病,男性儿童早期发病,表现为进行性四肢无力,肌肉萎缩,合并腓肠肌肥大,晚期四肢瘫痪.可累及心肌、呼吸肌,造成心力衰竭和呼吸衰竭,严重影响患者的生活质量,是疾病晚期致死主要原因[1-3].近年来由于非创伤性机械通气医疗技术的发展和应用,降低了因呼吸衰竭而导致DMD患者死亡的风险[4 ],使心肌损害的危害越来越突出.现将近年来DMD心肌损害相关研究进展综述如下.

假肥大型肌营养不良患儿的肌肉病理及dystrophin免疫组化SP法检测的临床意义

目的 探讨肌肉病理及抗肌萎缩蛋白(dystrophin)免疫组化SP法检测在假肥大型肌营养不良诊断中的临床价值.方法 通过组织学观察和免疫组化SP法检测方法,对50例假肥大型肌营养不良患儿[40例Duchenne型营养不良(DMD组),10例Becker型营养不良(BMD组)]肌纤维膜dystrophin的表达、肌肉病理改变及临床表现进行观察,并与30例其他疾病(多发性肌炎3例、皮肌炎6例、糖元累积病1例、脂质累积病15例、周围神经病2例、脊肌萎缩症3例)对照组患儿进行对比分析.结果 肌肉病理显示:DMD组中有30例肌肉病理改变较重,10例较轻;BMD组的肌肉病理改变较轻,这些均与年龄有关.免疫组化显示:DMD组肌肌纤维膜均有严重的dystrophin 缺失,BMD组肌纤维膜有50%～70%的dystrophin 缺失;对照组无dystrophin 缺失.结论 肌肉病理及dystrophin SP免疫组化检测对假肥大型肌营养不良具有较大的临床意义.

皮肤成纤维细胞中Dystrophin基因的表达研究

目的 研究皮肤成纤维细胞中Dystrophin mRNA和Dystrophin蛋白的表达.方法 组织块法体外培养正常鼠皮肤成纤维细胞,通过RT-PCR和Western blotting技术分别检测皮肤成纤维细胞中Dystrophin mRNA及Dystrophin蛋白的表达.结果 Dystrophin mRNA和Dystrophin蛋白在培养的皮肤成纤维细胞中均无表达.结论 皮肤成纤维细胞可作为细胞间遗传物质转移的供体细胞.

免疫组织化学dystrophin染色诊断Duchenne型肌营养不良症的研究

目的 探讨Duchenne型肌营养不良症(DMD)肌萎缩蛋白(dystrophin)表达规律和临床意义.方法 收集我院7例DMD患者作为试验组,7例非DMD患者为对照组.使用抗dystrophin杆状结构域单抗、免疫组织化学染色,观察肌膜dystrophin表达.结果 7例DMD患者肌细胞膜dystrophin阴性,7例非DMD患者dystrophin染色阳性.结论 证实DMD患者肌细胞膜dystrophin表达阴性,揭示dystrophin缺失是其发病机制,可以作为确诊DMD手段,对临床诊断DMD有实际意义.

视网膜眼电图对DMD/BMD携带者的检测价值探讨

目的 研究杜氏/贝氏进行性肌营养不良(DMD/BMD)携带者视网膜眼电图(ERG)的改变,探讨ERG对DMD/BMD携带者的诊断意义. 方法对22个基因突变类型明确的DMD/BMD家系,用定量PCR法结合系谱分析将家系中女性成员分成肯定携带者和非携带者,对患者和家系女性成员进行详细的眼科检查和ERG检测,并用ERG国际测量标准记录结果.结果 22名患者中17名出现异常ERG改变;11名肯定携带者中5名出现ERG异常,14名非携带者无ERG改变,两组无重叠.结论 ERG是一项对DMD/BMD诊断非常敏感和特异的检查,而ERG对携带者的诊断也具有一定的临床意义.

骨髓干细胞移植后mdx鼠腓肠肌病理及Dystrophin的表达变化

[目的] 研究骨髓干细胞移植后mdx鼠腓肠肌组织病理变化及dystrophin的动态表达变化.[方法] 7～9周mdx鼠20只平均分为4组,放疗后移植1.2×107个/只同种异基因全骨髓干细胞,于移植后4周、8周、12周及16周应用HE染色观察细胞形态及核中心移位(CNF),免疫组化及Western blot方法检测dystrophin表达变化,C57鼠和未治疗mdx鼠各5只作阳性和阴性对照.[结果] C57鼠腓肠肌横切面可见肌细胞大小形态基本一致,无核中移现象.各细胞移植治疗组和对照组mdx鼠均有大量的炎细胞浸润.核中心移位明显.未治疗mdx鼠CNF高,可达70%左右,移植后4周、12周和16周,CNF比例分别为55%、50%和44%.免疫荧光结果C57鼠肌膜呈完整的网状绿色荧光,mdx鼠肌膜基本未见绿色荧光;移植后4周肌膜dystrophin阳性纤维数大约占细胞总数的1%,随时间延长表达渐渐增多,8周、12周和16周时阳性细胞数分别占细胞总数的5%、10%和15%.Western blot结果mdx鼠无dystrophin的表达,野生型C57鼠表达量多,移植后4周mdx鼠仅见微弱表达,随时间延长表达量渐增,移植后16周表达量较移植8周明显增加.[结论] 骨髓干细胞移植后mdx鼠腓肠肌CNF随移植时间延长逐渐减少,dystrophin的表达随时间延长增多,提示骨髓干细胞移植后长久持续参与受损骨骼肌的修复与再生.

杜氏肌营养不良症的细胞治疗进展

杜氏肌营养不良症(DMD)为X-连锁隐性遗传,患病率为3.3/10万.本病发生是编码抗肌萎缩蛋白(Dystrophin,Dys)的基因突变引起.DMD患者骨骼肌呈反复退化和再生,终肌卫星细胞耗竭,骨骼肌被结缔组织和脂肪代替.患者往往在20岁左右因呼吸衰竭而死亡.目前DMD临床治疗效果仍不理想,本文就DMD细胞治疗实验及临床研究进行综述.

杜氏肌营养不良分子诊断技术的研究进展

杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy ，DMD）是一种X连锁隐性遗传致死性神经肌肉系统疾病，发病率高，占男性活婴的1／3500。临床表现为全身骨骼肌萎缩，进行性无力和小腿腓肠肌假性肥大，走路呈鸭形步态，30％患儿有不同程度的智力障碍。一般3～5岁隐袭发病，9～12岁丧失站立和行走能力，多于20岁左右因心、肺功能衰竭而死亡［1］。现阶段对DMD尚无有效的治疗方法，控制DMD的发生主要在于防止患儿的出生，阻断缺陷基因的传递。因此，产前诊断及母体携带者筛查是预防DMD发生的有效手段［2］。目前，DMD 的分子诊断方法多样且各有优、缺点，本文就DMD分子诊断技术的研究进展做一综述。

骨髓胚胎样干细胞体内重建dystrophin的表达

目的 观察骨髓胚胎样干细胞体内再生dystrophin的可行性.方法 采用SSP-PCR方法鉴定mdx小鼠的基因型.分离扩增入骨髓胚胎样干细胞,采用DIR标记后,注射细胞到mdx小鼠腹股沟三角皮下,采用活体成像法观察植入细胞的存活情况,采用免疫荧光染色法检测dystrophin的表达.结果 杂合子鼠交配可以产生3个基因型的子代鼠,采用SSP-PCR可以鉴定出mdx小鼠基因型;采用无血清培养基可从骨髓中分离到表达SSEA-4和FZD-9的胚胎样干细胞,可在注射细胞的mdx小鼠离体后肢肌肉检测到明显的荧光信号,并在肌肉组织中检测到人dystrophin的表达.结论 人骨髓胚胎样干细胞可在mdx小鼠体内存活并表达dystrophin.

儿童肌营养不良的肌肉utrophin表达研究

目的:探讨utrophin在儿童肌营养不良(muscular dystrophy,MD)患者肌肉表达的情况.方法:采用免疫荧光方法观察8例儿童MD及2例无神经肌肉疾病的正常肌肉活检标本utrophin的表达.结果:在dystrophin明显减少的Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)患者的部分肌膜上,utrophin表达呈弱阳性,沿肌膜断续性分布;在dystrophin中度减少的DMD患者肌膜上,utrophin阴性;在其他类型MD及正常对照的肌膜上,utrophin阴性.结论:儿童MD肌肉的utrophin表达与其dystrophin表达下降有关,且可能与患儿病情的严重程度相关.