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产前诊断除外肌营养不良蛋白基因外显子44移码突变一例
先证者,男,1+岁,临床诊断为杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD).该病发生主要原因是编码肌营养不良蛋白(dystrophin)基因的大片段缺失或突变[1].首先采用多重聚合酶链反应技术针对先证者及其父母的肌营养不良蛋白基因26个外显子(包括3、4、6、8、12、1 3、16、17、19、32、34、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、60、Pm、pb)进行检测,未见上述外显子缺失.进而采用多重连接依赖的探针扩增(multiplex ligation-dependcnt probe amplification,MLPA)法检测肌营养不良蛋白基因79个外显子,均未见缺失或重复.终经全基因测序发现先证者第44号外显子一处移码突变:NM_004006.1:c.6391_6392delCA(p.Gln2131AsnfsX3),而先证者父母的44号外显子同步测序均未见异常,且此突变未见报道.通过寡核苷酸多态性数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)、国际人类基因组单体型图计划(www.hapmap,org)和“华大基因千人基因组计划( www.genomics.cn)”中72个中国人样本的数据分析排除多态可能,同时经PDB数据库(www.pdb.org)蛋白功能预测可能造成膜蛋白结构域的改变,因此考虑此突变为新发或生殖腺嵌合造成的致病突变.
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先天性无虹膜症PAX6基因突变分析中应重视大片段缺失的检测
先天性无虹膜症遗传方式为常染色体显性遗传,致病基因是位于11号染色体l区3带的PAX6基因.PAX6基因的基因内突变和大片段缺失均可导致先天性无虹膜症,因此在其基因突变分析中应重视大片段缺失的检测.PAX6基因大片段缺失常用检测方法有染色体核型分析G带染色、免疫荧光原位杂交特异性探针、探针杂交多重扩增(MAPH)和探针连接多重扩增(MLPA)等,ML-PA法因具有高分辨率,操作简单等优点目前更为常用.
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多重连接依赖的探针扩增技术检测中国人遗传性非息肉病性结直肠癌错配修复基因大片段缺失
目的 了解中国人遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)家系hMSH2和hMLH1基因大片段缺失特点.方法 采用多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术和GeneMapper分析技术检测17个HNPCC家系先证者hMSH2和hMLH1基因种系大片段缺失.结果 在3个家系中分别发现hMSH2基因第8外显子、1～6外显子和1～7外显子3种大片段缺失类型,未发现hMLH1基因大片段缺失.大片段缺失占hMSH2和hMLH1基因总种系病理性突变的19%.结论 中国人HNPCC错配修复(MMR)基因大片段缺失发生率较高,hMSH2基因缺失可能更为常见.在分子遗传学检测中有必要开展MMR基因大片段缺失的检测.
关键词： 遗传性非息肉病性结直肠癌 大片段缺失 多重连接依赖的探针扩增 -
多重连接探针扩增技术在凝血因子Ⅸ基因大片段缺失的血友病B基因携带者诊断中的应用
目的 探讨多重连接探针扩增技术(MLPA)在血友病B(HB)基因诊断中的应用.方法 采用MLPA和短串联重复序列(STR)基因连锁分析对由于凝血因子Ⅸ(F9)基因大片段缺失导致测序失败的2个HB家系进行基因诊断.结果 MLPA检测结果显示,2例HB患者F9基因存在1或2个外显子的缺失,缺失位置Ratio值<0.10;患者母亲相应位置Ratio值为0.50±0.05,可判断为携带者;其他女性受检者Ratio值为0.71～1.30,可排除携带者.基因连锁分析与MLPA判断结论一致.结论 MLPA为HB的直接基因诊断提供了一种新的方法,可用于测序无法检出的F9基因大片段缺失的携带者诊断.
关键词： 多重连接探针扩增技术 血友病B 基因诊断 大片段缺失 -
亨廷顿舞蹈病3家系线粒体DNA编码区大片段缺失的检测
目的:研究线粒体DNA(mtDNA)编码区大片段缺失与亨廷顿舞蹈病(HD)之间的关系.方法:采用PCR对3个HD家系中的10名患者和26名正常人的mtDNA编码区大片段缺失进行检测.结果:共6名患者和16名正常人存在mtDNA编码区大片段缺失,其中1名患者存在多重缺失,6名正常人存在多重缺失.结论:未发现mtDNA编码区大片段缺失与HD有特异相关性.
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MLPA技术在检测胰腺癌细胞系9p21大片段缺失中的应用
目的:评价MLPA技术检测染色体9p21区大片段缺失的有效性及判断缺失边界的准确性,并探讨染色体9p21区大片段缺失的意义.方法:利用MLPA技术检测胰腺癌细胞系PANC-1和BxPC3的9p21区缺失情况,并利用常规PCR实验对MLPA缺失边界进行验证.结果:MLPA检测发现PANC-1和BxPC3均存在累及MTAP、CDKN2A和CDKN2B等基因大片段缺失的情况.PCR实验证实MLPA对PANC-1端粒侧的缺失边界判断准确.PANC-1细胞系染色体9p21区大片段缺失的端粒侧缺失断点位于MTAP基因内.结论:MLPA技术是检测染色体9p21大片段缺失的有效方法,能准确判断大片段缺失边界范围,适合于aCGH检测后大样本筛查.PANC-1细胞系中染色体9p21区大片段缺失可能改变MTAP基因结构.
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MECP2基因大片段缺失致Rett综合征表型分析
目的：研究Rett综合征（Rett syndrome , RTT）致病基因甲基化CpG结合蛋白2（Methyl-CpG-bind-ing protein 2, MECP2）大片段缺失突变的3例患儿表型特征。方法对于编码区未检出致病突变而临床表现疑为RTT的7例患儿采用定量PCR技术检测MECP2基因有无缺失突变，随后依据现行修订诊断标准进行随访，明确患儿患病类型。结果1例因不满足诊断标准被排除。3例检出大片段缺失突变，其中2例典型RTT，1例非典型RTT；余3例未检出片段缺失。结论 MECP2大片段缺失突变为RTT常见致病原因且定量PCR对于常规突变筛查方法未检出MECP2突变的患儿是一种简单快速的诊断方法。
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构建SD大鼠鱼藤酮中毒模型及其线粒体DNA突变的初步探索
目的 构建SD大鼠鱼藤酮慢性中毒模型,同时对SD大鼠组织标本(脑组织和肝脏)进行线粒体DNA突变的初步探索,为后续实验提供线索.方法 将75只雄性SD鼠随机分为三组,实验组:0.5 mg/(kg· d)鱼藤酮皮下注射4～8周,共45只;空白组:不予任何特殊处理4～8周,共15只;对照组:相同体积的二甲基亚砜(DMSO)皮下注射4～8周,共15只.其中实验组随机分为1、2、3小组,每小组15只;空白组和对照组也分别分为1、2、3小组,每小组5只.每组内相应的1、2、3小组分别在实验的第4、6、8周处死老鼠并留取相应的组织标本(中脑组织和肝脏),存储于-80℃冰箱中待用.在实验组的每个小组内分别随机选取3对组织标本,共9对;在空白组和对照组的每个小组内分别随机选取1对组织标本,共6对.随后进行组织DNA提取,采用2对引物进行长PCR并将PCR产物进行凝胶电泳分析,同时设计并利用线粒体DNA引物,用一代测序的方法进行线粒体全基因组测序.实验中观察各组大鼠的一般情况并进行行为学测试.结果 1)实验组大鼠在实验中表现出较为明显的中毒症状.在体重增长速度上与对照组和空白组存在明显差异(P＜0.05).在行为学上,实验组大鼠亦表现出了较为明显的行为学异常(P＜0.05).2)大鼠脑以及肝脏组织的长PCR凝胶电泳结果未发现明显的异常条带;所有测序突变(缺失、插入、点突变)均为大鼠固有突变.结论 0.5 mg/(kg·d)鱼藤酮皮下注射4～8周可导致SD大鼠鱼藤酮慢性中毒.SD幼鼠的选择、鱼藤酮剂量及作用时间、一代测序等多种因素可能是导致本次实验未检测到有意义的线粒体DNA突变的原因.因此,后续实验应做相应改进.
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83例苯丙酮尿症患者pah基因大片段缺失的检测
目的 探讨苯丙酮尿症(PKU)患者苯丙氨酸羟化酶(pah)基因大片段缺失的情况.方法 选择2015年1月至2016年1月在郑州大学第三附属医院科研中心进行基因检测的83例苯丙酮尿症患儿为研究对象,通过Sanger测序技术和多重连接探针扩增技术(MLPA),对患儿pah基因13个外显子及其两侧的内含子剪接区的碱基序列进行分析,在测序结果的基础上,将结果与同人类基因组数据库hg19、pah突变数据库pahbase和人类基因突变数据库HGMD中的数据进行比对分析,确定患儿pah基因的大片段缺失情况.结果 在83例患儿中共检测到162个突变等位基因,其中点突变57种,大片段缺失突变6种,6种大片段缺失突变发生于pah基因的第1、4、5、6、7外显子.结论 MLPA筛查是必要的且能发现大片段缺失的有效方法,同时联合Sanger测序技术可以提高苯丙酮尿症的诊断率.
关键词： 苯丙酮尿症 苯丙氨酸羟化酶 大片段缺失 多重连接探针扩增技术 -
成骨不全症家系 COL1A1/2基因的大片段缺失突变分析
目的：在成骨不全症(osteogenesis imperfecta,OI)家系中进行 COL1A1/2基因内大片段缺失突变的鉴定。方法应用多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)方法对46例 PCR-测序未见 COL1A1/2基因突变的 OI 患者进行COL1A1/2基因大片段缺失突变检测,进一步应用荧光定量 PCR 或 Gap-PCR-测序法对 MLPA 方法检测到的缺失突变进行验证。结果通过MLPA 分析,在46例 OI 患者中检测到2例杂合性大片段缺失突变,先证者 A 为整个 COL1A1基因的杂合缺失,先证者 B 为COL1A2基因第20外显子的杂合缺失；荧光定量 PCR 结果证实先证者 A 携带整个COL1A1基因的杂合缺失突变；Gap-PCR、DNA 测序和凝胶电泳分析结果证实先证者 B 存在COL1A2基因内第17~23外显子的杂合缺失,断裂点区域有一个来自于5号染色体、长度637 bp 的 DNA 插入片段；先证者 B 家系成员突变验证显示其母亲为同一突变的杂合子。结论在中国人 OI 患者中发现了COL1A1和COL1A2基因的大片段缺失突变。本研究结果丰富了中国人群 I 型胶原相关 OI 致病基因突变谱,也为患病家系的产前基因诊断奠定了基础。
