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Pax6基因的Arg67Arg与Thr166Thr突变致胰岛素分泌减少所致糖代谢异常与早发2型糖尿病的相关性研究
目的 探讨Pax6基因的Arg67Arg与Thr166Thr突变致早发T2DM的临床特点. 方法 选取早发T2DM患者112例(T2DM组)和OGTT正常者98名(NGT组),采用聚合酶链式反应(PCR)测定两组Pax6基因突变/变异情况,比较FPG、2 hPG、FIns等指标. 结果 T2DM组检出Pax6基因外显子6的Arg67Arg(A→G)突变,突变型等位基因G和野生型A基因频率分别为2.23％和97.77％,未检出Pax6基因外显子7的Thr166Thr(T→C)突变;NGT组未检测到Pax6基因Arg67Arg和Thr166Thr突变;AG基因型患者FPG和2hPG水平高于AA基因型患者,而FC-P、2 hC-P、FIns和2 hIns水平低于AA基因型患者(P＜0.05). 结论 Pax6基因的Arg67Arg与Thr166Thr突变可能不是人群早发T2DM的易感标志,但Arg67Arg突变可加剧胰岛素分泌的减少.
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先天性无虹膜症PAX6基因突变分析中应重视大片段缺失的检测
先天性无虹膜症遗传方式为常染色体显性遗传,致病基因是位于11号染色体l区3带的PAX6基因.PAX6基因的基因内突变和大片段缺失均可导致先天性无虹膜症,因此在其基因突变分析中应重视大片段缺失的检测.PAX6基因大片段缺失常用检测方法有染色体核型分析G带染色、免疫荧光原位杂交特异性探针、探针杂交多重扩增(MAPH)和探针连接多重扩增(MLPA)等,ML-PA法因具有高分辨率,操作简单等优点目前更为常用.
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Pax6基因在视网膜母细胞瘤发生发展中的作用
恶性肿瘤是当今威胁人类健康和生命的主要疾病之一,视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)是小儿常见的原发性眼内恶性肿瘤,仅次于白血病,占小儿恶性肿瘤的第二位.近年来,其发病率有上升趋势,严重危害患儿的视力和生命[1].但是,Rb发生的确切机制尚不清楚,因此对Rb的保守治疗仍面临着巨大的挑战.
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Pax6基因纯合突变胎鼠上前牙区额外牙发生的初步研究
研究Pax6基因纯合突变胎鼠上前牙区额外牙的发生情况,为研究Pax6在上前牙发生、发育中的作用及额外牙的发生机制提供依据.方法收集E18.5 DEBA Pax6基因纯合突变胎鼠20只,制作胎鼠头部组织冠状面石蜡连续切片,HE染色,观察上前牙区额外牙的发生情况;E18.5 C57BL/6NCrlBR Pax6基因野生型胎鼠18只作为对照.结果 20只Pax6基因纯合突变胎鼠中,4只上前牙区显示有额外牙牙胚;18只Pax6基因野生型胎鼠上前牙区均无额外牙牙胚.Pax6基因纯合突变胎鼠和Pax6基因野生型胎鼠的下前牙区和上下颌第一、第二磨牙区牙胚的数目相同,形态结构未见明显差别.结论本实验结果提示Pax6基因在胎鼠上前牙发生过程中有非常重要的作用.
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PAX6基因R203X无义突变导致家族性先天无虹膜
目的 探讨一个先天性无虹膜家系致病的分子基础.方法 对一个先天性无虹膜家系进行全面的眼部检查,采集该家系的4例患者和两名健康成员外周静脉血,提取基因组DNA.采用DNA直接测序的方法分析无虹膜候选致病基因PAX6的14个外显子及其外显子-内含子拼接部的序列.结果 该家系患者PAX6基因第8外显子存在一个杂合性突变c.C607T,导致编码蛋白在203位的精氨酸(p.R203X)处提前终止,产生一个变异蛋白;而家系正常成员未发现此突变,表型与突变位点呈共分离.结论 c.C607T(p.R203X)突变是PAX6基因导致无虹膜的突变热点之一,也存在于中国无虹膜家系中.
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慢病毒载体Pax6-EGFP构建及转染人骨髓间充质干细胞
背景：Pax6基因是影响眼发育、分化的关键基因，获得过表达Pax6基因的稳定细胞株是研究其对骨髓间充质干细胞分化作用的首要任务，也是干细胞替代治疗的研究基础。
目的：构建重组慢病毒载体Pax6-EGFP，体外转染人骨髓间充质干细胞，检测Pax6基因在人骨髓间充质干细胞中的表达情况。
方法：利用PCR法从人Pax6 cDNA基因克隆载体pGEM-PAX6上扩增Pax6目的片段，将其与XbaⅠ和BamHⅠ双酶切的慢病毒载体pHIV-EGFP连接，转化感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆提取质粒，测序鉴定。经293T细胞包装后，收集含病毒颗粒的上清液，体外转染人骨髓间充质干细胞，同时设立阴性对照组(pHIV-EGFP空载体)。荧光显微镜下观察转染是否成功，Real time PCR检测转染细胞Pax6基因的表达。
结果与结论：①酶切电泳及基因测序证实携带Pax6基因的慢病毒载体构建成功，包装后获得滴度为3×109 pfu/L的Pax6-EGFP重组载体；②转染人骨髓间充质干细胞后，在荧光显微镜下可以发出绿色荧光，且荧光强度不随培养时间延长而衰退；③经Real time PCR检测，被转染细胞内有Pax6基因表达，表明慢病毒转染是一种安全高效的基因修饰手段，能够使外源基因整合到宿主细胞基因组中。 -
Pax6基因在BXD重组近交系小鼠眼组织的差异表达及基因调控网络的构建
目的 探讨Pax6基因突变在某些先天性眼部疾病中可能的作用机制.方法 采用Affymetrix基因芯片检测确定68个品系的BXD重组近交系(BXD RI)小鼠及其亲本C57BL/6J (B6)和DBA/2J (D2)小鼠、F1代眼组织中Pax6基因的差异表达.借助基因表达数量性状基因座(eQTL)分析方法,结合Gene Network网站的在线分析工具,研究Pax6基因表达上游调控基因,并进一步构建Pax6基因调控网络.结果 Pax6基因(1452526_a_at)在BXD RI小鼠的眼组织中呈高表达,不同品系小鼠表达量存在差异.Pax6基因具有1个显著性eQTL,位于19号染色体近测端,其似然比统计值达到15.80.磷酸肌醇4磷酸盐5激酶1α(Pip5k1a)是Pax6的上游调控候选基因.827个基因与Pax6基因具有高度遗传相关性(P＜0.05).结论 Pax6是一个反式调节基因;其表达量受上游调控候选基因Pip5k1a的调控.在Pax6基因突变导致先天性眼部疾病过程中涉及到细胞凋亡、脂质代谢、血管分化、细胞增殖和迁移等多种机制.
关键词： 基因组学 Pax6基因 基因网络 BXD重组近交系小鼠 -
先天性无虹膜家系中发现PAX6基因新的致病突变
目的 对中国一先天性无虹膜家系进行PAX6基因突变检测,以确定其突变位点.方法实验研究.收集一先天性无虹膜家系,采集该家系患者及健康成员的外周静脉血,收集100名健康人外周血作为正常对照,采用Sanger测序的方法对PAX6基因的11个外显子(外显子4-14)以及外显子-内含子连接区域进行测序,随后进行家系共分离分析以及正常样本的对照分析.结果该家系8名成员经全面眼科检查,3名确诊为先天性无虹膜,且合并有复杂的眼部表型,包括不同程度的角膜病变、不同类型的白内障、黄斑发育不良、轻度上睑下垂和轻度眼球水平震颤等.在该家系患者中发现一个新杂合突变[c.569_570delinsACGG(p.Ile190Asnfs*18)],该突变可致PAX6基因编码的蛋白截短,该突变符合共分离且在100名正常对照者中未检测到.结论PAX6基因第8外显子上一个新的杂合突变[c.569_570delinsACGG(p.Ile190Asnfs*18)]为本研究中先天性无虹膜家系的致病突变,该突变与先天性无虹膜有关,本研究扩大了PAX6基因的突变频谱.
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一先天性无虹膜家系PAX6基因遗传筛查及临床表型
目的 探讨我国常染色体显性遗传先天性无虹膜一家系患者的致病基因突变位点及其临床表型.方法 实验研究.于南京医科大学第一附属医院眼科收集一先天性无虹膜家系,共8名家庭成员,其中3名患者,2名正常同胞,3名配偶.完善该家系内所有参与者的眼科检查,采集该家系成员的外周静脉血,提取基因组DNA,扩增PAX6基因的全部编码区及外显子-内含子交界区剪切位点附近的序列,直接测序法确定该家系的致病突变.结果 遗传学筛查结果证实该家系的致病突变为位于PAX6基因第7号外显子与第7号内含子交接处的杂合突变(c.357+5G＞A).生物信息学分析结果表明该突变可导致正常剪切位点的缺失,产生移码突变,形成截短蛋白p.Ser1 21Asnfs*30.该家系中3例患者均表现出典型的先天性无虹膜症的临床表型,表现为虹膜发育不全,与此同时,该家系内患者还具有上睑下垂、白内障、眼球震颤、青光眼及玻璃体混浊等眼部异常.结论 PAX6 c.357+5G＞A杂合突变为该家系的致病突变,是该家系发生先天性无虹膜及上睑下垂、白内障、眼球震颤、青光眼及玻璃体混浊等一系列临床表型的主要致病原因.
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先天性无虹膜家系致病基因的突变检测
目的 对一常染色体显性遗传的先天性无虹膜( AN)家系进行PAX 6基因突变筛查,以确定其致病基因及致病突变.方法 收集一常染色体显性遗传的AN家系,采集该家系患者、家族健康成员外周静脉血,提取基因组DNA,应用聚合酶链式反应( PCR)方法扩增PAX 6 基因exon 4 ~exon 13共11个外显子以及外显子-内含子拼接部,将纯化后的PCR扩增产物直接测序,运用DNAStar软件(综合性序列分析软件)对测序结果进行序列分析,检测PAX 6基因的突变类型,并与80名随机抽取的与该家系无血缘关系的健康人PAX 6基因序列进行比对. 结果 该家系患者PAX 6 基因exon 11存在一个杂合突变c. 949 C>T(P. R 317 X),导致第317位精氨酸的密码子CGA被终止密码子UGA替代,造成编码PAX 6蛋白的过早终止,而该家系其他健康成员及80名与该家系无血缘关系的健康对照组成员均未检测到该突变. 结论 PAX 6基因c. 949 C>T( P. R 317 X)突变导致PAX 6蛋白提前编码终止是该常染色体显性遗传先天性无虹膜家系的致病原因.
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一先天性无虹膜家系PAX6基因的突变检测
目的 对一常染色体显性遗传的先天性无虹膜家系进行配对盒基因(PAX6)突变检测,以鉴定其致病基因.方法 收集一常染色体显性遗传的先天性无虹膜家系,采集该家系患者及其家族成员的外周血,提取基因组DNA,利用PCR扩增PAX6基因的全部外显子及外显子内含子连接处,直接测序,测序结果用DNAStar软件进行突变分析.并随机抽取100名健康人外周静脉血,进行PCR,测序检测,作为对照.结果 无虹膜家系中患者均发现PAX6基因在第9内含子与第10外显子交界处出现杂合突变(IVS9-1G＞ A),导致DNA剪接异常.结论 PAX6基因的IVS9-1G＞A突变使DNA剪接异常,导致蛋白质的改变,这可能是该常染色显性遗传家系先天性无虹膜的致病原因.
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全外显子组测序技术对两个眼前节发育不良家系致病基因检测
目的 筛查两个眼前节发育不良(anterior segment dysgenesis,ASD)家系的致病基因突变.方法 对2个来自河北和河南的ASD家系进行分析.在获得受检者同意后,对家系成员进行详细的眼科检查,采集外周静脉血,提取全基因组DNA.依据测序需求选取家系1中2例患者及1名正常对照、家系2中1例患者及1名正常对照进行全外显子组测序,对测序结果筛选候选基因,运用Sanger测序进行验证.利用PolyPhen-2,SIFT HumanSplicing Finder软件进行突变危害性预测.结果 家系1连续3代均有患者发病,符合常染色体显性遗传特征,9例患者有均不同程度的双眼ASD.得到13个SNV和55个InDel候选突变,在候选基因PAX6中,家系1发现一已知错义突变c.T2A(p.M1K);家系2中共8名成员,其中2例患者,在测序中发现一已知剪切位点突变c.357+ 1g＞c.3个预测软件作出危害性预测.结论 外显子测序技术快速检测出PAX6基因中T2A(p.M1K)和c.357 +1g＞c突变,并确定其为ASD的致病突变.
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常染色体显性遗传眼球震颤家系的临床表型及致病基因的研究
目的 研究1个中国人常染色体显性遗传性眼球震颤家系的临床特点,并通过候选基因直接测序的方法对该家系的致病基因及发病机制进行研究.方法 选择1个先天性眼球震颤家系,对家系所有成员进行全身检查及视力、眼位、眼球运动、眼球震颤中间带、验光等眼科的相关检查后,从家系中每一代各选1例患者(包括先证者)及正常人,进行候选基因FRMD7、GPR143与PAX6基因的外显子测序.结果 家系患者的眼球震颤为水平冲动型,并且具有中间带.除了先证者有部分眼组织缺损及小眼球等异常外,其余患者的眼前节均未见明显发育异常.家系患者PAX6基因第7外显子的第382碱基发生了杂合突变(c.C382T),从而引起了氨基酸的改变(p.R128C),该突变可能影响了PAX6蛋白与其调控的下游基因的调控序列的结合,进而导致PAX6基因功能异常,影响眼部发育.结论 该常染色体显性遗传性眼球震颤家系的致病基因为PAX6基因.
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先天性无虹膜家系Pax6基因的突变研究
目的 对一先天性无虹膜症家系的致病基因Pax6基因进行突变检测分析.方法 对该家系进行家系调查及外周血样本采集,Pax6基因全部外显子测序,使用美国ABI PRISMTM 377XL DNA自动测序仪,应用双脱氧末端终止法进行序列分析;用MspI进行突变鉴定.结果 该家系共5代58人,患病21例,采集血样28人份,测序结果发现Pax6基因R254X(760C＞T)突变.结论 先天性无虹膜症的遗传方式为常染色体显性遗传,呈高度临床及遗传异质性,无义突变R254X(760C＞T)为一新突变.
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先天性无虹膜患者Pax6基因突变筛查
背景 先天性无虹膜是一种罕见的先天性常染色体显性遗传疾病,表现为双眼无虹膜,目前已知配对盒基因6(Pax6)突变与先天性无虹膜相关. 目的 对先天性无虹膜患者进行Pax6基因突变筛查.方法 纳入2012年8月至2015年10月在天津市眼科医院就诊的先天性无虹膜患者11例,包括来自3个先天性无虹膜家系的6例患者及5例散发病例,所有患者均接受常规眼科检查.采集所有患者的外周静脉血各3 ml,按照DNA分离试剂盒说明书描述的标准流程提取DNA,对Pax6和Elp4基因全部外显子、外显子5'和3'端与内含子拼接部序列、SIMO序列进行PCR扩增,采用Sanger直接测序法以及多重连接探针扩增技术(MLPA)对患者的Pax6基因进行序列分析,并与500例无眼前节异常的眼外伤患者的测序结果进行比对.结果 所有患者均虹膜缺如,视力为手动/眼前,1例患者存在晶状体脱位.直接测序结果发现,AN-01家系中的3例患者均携带Pax6基因c.688g＞t(p.E230X)突变,5例散发病例中3例携有Pax6基因突变,分别为c.468g＞a(p.W156X)、c.613c＞t(p.Q205X)和c.141+2t＞c突变,其中c.688g＞t (pE230X)为新发现的突变.AN-02家系的1例患者、AN-03家系的2例患者及另2例散发病例经直接测序和MLPA验证,均未发现Pax6、Elp4基因以及SIMO片段的突变.500名正常个体均未发现上述突变.结论 先天性无虹膜可由Pax6基因突变引起,c.688g＞t(p.E230X)为新发现的Pax6突变体,扩大了Pax6基因突变谱.
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shRNA-PAX6慢病毒载体构建及其对胶质瘤U251细胞增殖的影响
目的 构建shRNA-PAX6慢病毒载体并观察其对胶质瘤U251细胞增殖的影响.方法 根据文献报道的PAX6靶点序列,设计两条PAX6基因的siRNA靶点干扰序列,引物退火形成带粘性末端的双链,与经BamH I、EcoR I双酶切后线性化的慢病毒载体进行连接、转化,构建shRNA-PAX6慢病毒重组载体,再经菌落PCR及测序鉴定重组载体;在293T细胞中包装病毒,将包装后的shRNA-PAX6慢病毒重组载体感染U251细胞.Real-time PCR检测PAX6 mRNA的表达水平,Western blot检测PAX6蛋白的表达,MTT法检测U251细胞增殖.结果 慢病毒载体pLKD-CMV-G&NR-U6-shRNA经双酶切后可见线性化的8208 bp大片段,菌落PCR及测序鉴定证实shRNA-PAX6慢病毒重组载体构建成功,构建的shRNA-PAX6慢病毒载体在293T细胞完成包装,测得慢病毒滴度为6.73×108TU/mL;Real-time PCR结果显示,沉默PAX6的表达可见U251细胞PAX6 mRNA表达水平明显低于正常对照组及慢病毒空载体组(P<0.05);Western blot结果显示,PAX6蛋白表达亦明显低于正常对照组及慢病毒空载体组(P<0.05);MTT结果显示,与正常对照组及慢病毒空载体组细胞比较,感染shRNA-PAX6慢病毒重组载体组的细胞,细胞增殖能力明显增强(P<0.05).结论 成功构建人PAX6基因的shRNA-PAX6慢病毒重组载体,沉默PAX6基因的表达,U251细胞的增殖能力增强.
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一个先天性无虹膜家系PAX6基因的新突变
目的 通过分子遗传学分析,确定中国东北地区一个先天性无虹膜家系PAX6基因的突变位点.方法 采集一个家系3例先天性虹膜患者及5名健康成员和100名正常对照者的外周静脉血,应用聚合酶链反应,直接测序法,单链构象多态性技术以及T载体克隆测序等方法确定其突变位点.结果 患者为第5外显子从483位点开始9个碱基缺失的框内缺失突变:其密码子位置为41～43,即缺失门冬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸3个氨基酸(c.483del9).结论 PAX6基因是先天性无虹膜的致病基因,发现了PAX6基因一个新的突变位点.
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一个先天性无虹膜家系PAX6基因突变分析
目的 研究1个遗传性先天性无虹膜家系患者发病的分子遗传学机制.方法 应用PCR产物直接测序法对1个遗传性先天性无虹膜家系的2例患者(先证者及其母亲)和1名正常家系成员的PAX6基因编码区的15个外显子(第1～1 5外显子)进行突变分析.结果 先证者及其母亲的PA X6基因第1 3外显子均发现c.957-958delCA突变,其父亲未检测到相同突变；PAX6基因其它外显子均未发现序列异常.结论 PAX6基因第1 3外显子c.957-958delCA突变是该家系发生先天性无虹膜病的主要原因.
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一个先天性无虹膜合并白内障家系PAX6基因突变研究
目的 鉴定一个先天性无虹膜合并白内障家系的致病是否与PAX6基因突变有关.方法 提取该家系全部12名存活成员和96名正常人外周血白细胞DNA,PCR扩增PAX6基因的第4～13编码外显子及侧翼内含子剪切区域,通过直接测序比较家系患者与正常人序列差异以确定致病突变.结果 对PAX6基因序列分析结果显示,该家系3例患者中均存在一个无义突变,而在正常人和家系中非受累成员中则未发现.无义突变位于PAX6基因第10外显子1143位核苷酸c.1143C>T,突变导致精氨酸替换为终止密码(R261X).结论 PAX6基因突变R261X是中国人先天性无虹膜合并白内障的致病突变.
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一个先天性无虹膜家系PAX6基因突变研究
目的 对一个先天性无虹膜家系进行致病基因研究.方法 采集患者外周静脉血,提取基因组DNA.采用微卫星标记物D11S904和D11S935对1个先天性无虹膜家系进行连锁分析;采用直接测序对PAX6基因全部14个外显子,以及外显子内含子拼接部进行序列分析.结果 在微卫星位点D11S904获得LOD值为3.01.该家系患者PAX6基因第9外显子检出R240X突变,而家系正常人以及100名正常对照无此基因突变.结论 R240X再发突变是导致先天性无虹膜的突变热点.
