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多重连接探针扩增技术应用于22q11.2微缺失产前诊断的价值
目的 探讨多重连接探针扩增(MLPA)技术应用于产前诊断22q11.2微缺失的临床应用价值.方法 选择2011年5月至2012年12月在南京医科大学附属南京妇幼保健院经胎儿超声心动图检查诊断为先天性心脏畸形、常规G显带染色体核型分析正常的胎儿62例,采用MLPA技术检测胎儿是否存在22q11.2微缺失,对阳性样本进行父母溯源;并采用微阵列比较基因组杂交(arrayCGH)技术进行全基因组扫描分析,验证MLPA检测结果.结果 MLPA检测结果显示,在62例心脏畸形胎儿中共检出5例22q11.2微缺失,阳性检出率为8％ (5/62),其中4例是3M大小的典型微缺失,父母溯源为新发突变;1例是1.5M大小的微缺失,遗传于胎儿父亲.arrayCGH分析验证了22q11.2微缺失的存在及缺失的位置和大小.结论 MLPA用于产前诊断先天性心脏畸形胎儿的22q11.2微缺失具有临床指导价值,可为遗传咨询、生育指导和出生后干预提供依据.
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运用多重连接探针检测DMD
目的 杜氏肌营养不良是是由于抗肌萎缩蛋白的缺失、重复及点突变所致的一种X-连锁隐性遗传性神经肌肉病.目前运用多重PCR检测此基因热点区可以检测大部分病人的缺失突变,然而多重PCR不能检测非热点区及重复突变,且不能定量分析拷贝数.运用多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)检测DMD可为临床诊断及产前诊断提供依据.方法 本实验采用的多重连接探针扩增(MLPA)能快速、准确、半定量地分析患者及携带者缺失与重复突变的拷贝数,且检测范围涉及整个基因.结果 15例DMD患者9例是由于缺失突变所致,6例未检测到缺失突变及重复突变.其中7例缺失突变病人经"一步到位法"多重PCR验证,2例缺失突变病人经多重PCR未检测到的缺失突变.结论 MLPA是一种快速、准确、简便检测缺失及重复突变的方法.利用MLPA能检测所有DMD患者及携带者的缺失和重复突变.
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MLPA在诊断1例复杂性先天性心脏病中的应用
目的：采用多重连接探针扩增技术（MLPA）对脐带血标本进行进行检测，分析在复杂性先天性心脏病诊断中应用的诊断价值。方法①对1例复杂性先天性心脏异常胎儿取脐带血3 mL 脐带血细胞进行培养和标本制作，利用 G 显带技术对染色体核进行分析；②并取200μL 提取 DNA 后采用 MLPA 技术进行检测。结果 G 显带染色体核型分析46，XY，MLPA 检测结果为与先天性心脏病相关的2个探针对应的片段大小位置在3100的电泳图上荧光峰值相比正常对照明显出现减半，统计缺失区域的荧光比值为0.450和0.339（正常值：0.7~1.3）。结论患儿在与先天性心脏病相关的基因位点（GATA4）的上游存在杂合性缺失，缺失的片段大小约为1.5kb。
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早期B细胞因子1基因异常在儿童急性B淋巴细胞白血病中的意义
目的 了解早期B细胞因子1(EBFl)基因异常在急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿中的发生情况,并进一步分析EBF1基因异常与B-ALL患儿预后的相关性.方法 应用多重连接探针扩增(MLPA)技术检测2008年4月至2013年4月中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所儿童血液病诊疗中心初诊的B-ALL195例患儿EBF1基因异常情况.根据有无EBF1基因缺失将所有B-ALL患儿分为EBF1缺失组和非EBF1缺失组.结果 195例中15例(7.7％)发生EBF1缺失.两组初诊各项临床特征差异无统计学意义(P＞0.05).Kaplan-Meier法分析显示EBF1缺失组无病生存率(DFS)及无事件生存率(EFS)明显低于非EBF1缺失组[(59.5±14.8)％ vs.(85.5±3.2)％;(55.6±14.3)％ vs.(84.2±2.9)％;P均＜0.05].但两组总生存率(OS)差异无统计学意义[(86.7±8.8)％vs.(91.9±2.1)％,P＞0.05].Cox法分析显示在排除多项影响因素后,EBF1缺失仍为影响患儿DFS及EFS的不利因素(P＜0.05).结论 部分B-ALL患儿初诊时伴EBF1基因缺失,EBF1缺失为B-ALL患儿DFS及EFS的独立危险因素.
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Duchenne型肌营养不良基因诊断技术的发展及其哲学评析
Duchenne型肌营养不良(DMD)是发病率较高的神经系统遗传病,其基因突变机制复杂,探索简便、准确的基因突变检测技术是DMD研究的热点之一.随着分子生物学的进展,DMD基因诊断技术不断发展,经历了DNA印迹杂交、聚合酶链反应、生物芯片、多重连接探针扩增等.其发展过程带给我们许多哲学思考.
关键词： Duehenne型肌营养不良 基因诊断 哲学 生物芯片 多重连接探针扩增 -
中国闽南46个假肥大肌营养不良征家系的遗传分析及疾病区域预防体系构建探讨
目的 获得中国闽南地区假肥大型肌营养不良征(Duchenne and Becker muscular dystrophy,DMD/BMD)患者的分子遗传特征数据,为今后建立区域疾病三级预防体系提供理论依据.方法 通过对从2007年7月至2016年12月间,于福建省厦门市妇幼保健院就诊的46个闽南籍 DMD/BMD 病例家系进行遗传分析,评价该区域的疾病诊断及预防效果.结果 在41个家系中发现 DMD 基因变异,其中外显子缺失型/重复型分别为31例和5例;另有5例检出 DMD 基因单碱基变异,其中4例变异位点经分析定性为致病性突变,另1例变异位点临床意义不明;对3例经产前诊断确认携带致病突变的男性胎儿实施人工干预.结论闽南籍 DMD/BMD 患者中接近八成者属于 DMD 基因片段重组型,利用多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)可实现此类患者及携带者的准确诊断;高通量测序技术在非基因重组型 DMD/BMD 的诊断中具有优势;构建三级预防体系可显著降低疾病的发生率.
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多重连接探针扩增技术在胚胎停止发育染色体非整倍体异常分析中的应用
目的:探讨多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术在分析胚胎停止发育(以下简称胚胎停育)流产绒毛组织染色体非整倍体异常中的应用,探讨染色体非整倍体异常导致胚胎停育与胎儿性别、患者年龄间的关系.方法:收集324例临床诊断为胚胎停育患者的流产绒毛组织,采用MLPA技术进行染色体检测,并分析检测结果与胎儿性别及患者年龄间的相关性.结果:在324例胚胎停育患者中,检出绒毛染色体非整倍体异常共68例(20.99％),其中常染色体三体33例(13-三体12例、18-三体6例、21-三体15例),常染色体缺失3例(13-单体1例、21-单体2例),性染色体数目异常32例(45-XO 15例、47-XXY 13例、47-XXX 1例、47-XYY 3例).常染色体数目异常组与染色体数目正常组间的胎儿性别分布差异无统计学意义(P＞0.05).对绒毛染色体数目正常组[平均年龄(32±6)岁]、常染色体数目异常组[平均年龄(34±7)岁]、性染色体数目异常组[平均年龄(28±6)岁]3组患者的年龄进行比较,发现差异有统计学意义(P＜0.05).结论:MLPA技术可以作为一种辅助检测手段,用于检测胚胎停育流产绒毛组织染色体的非整倍体异常,染色体数目异常导致的胚胎停育与胎儿的性别无关,但与患者的年龄有关,胚胎常染色体数目异常组的孕妇年龄大于染色体数目正常组及性染色体数目异常组.
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22q11.2微缺失综合征的分子诊断及缺失范围检测
目的 分别采用多重连接探针扩增技术(MLPA)与荧光原位杂交技术(FISH)对22q1 1.2微缺失综合征外周血标本患者基因缺失/重复突变的类型及变异范围进行检测,分析在22q11.2微缺失综合征诊断中二者联合应用的诊断价值.方法 采集1例仅心脏异常患儿及其父母外周血,取200 μL外周血提取DNA后采用MLPA技术对患儿及其父母的染色体22q11.2缺失的范围进行检测,取外周血1 mL进行培养,采用DiGeorge/VCFS N25(D22S75)的FISH探针对培养后的中期淋巴细胞进行杂交.结果 患儿淋巴细胞分裂中期细胞应用FISH技术检测结果为22号染色体上的DiGeorge/VCFS N25(D22S75)区杂合性缺失；MLPA验证结果显示患儿与22q11.2微缺失综合征相关的6个探针对应的片段大小位置在3100的电泳图上荧光峰值相比健康对照明显出现减半,其父母亲均在正常范围.患儿的临床表现仅有先天性心脏病,无其他异常,与其基因缺失片段长度(2.0 Mb)极不相称.结论 联合应用FISH和MLPA检测22q11.2微缺失综合征,可以明显提高诊断的准确性.22q11.2微缺失综合征的临床表现与基因缺失片段的长度无相关性.
关键词： 22q11.2微缺失综合征 多重连接探针扩增 荧光原位杂交 -
PAX5缺失对于儿童无特殊重现染色体异常B系急性淋巴细胞白血病的预后意义
目的：初步了解PAX5缺失在无特殊重现染色体异常的B系急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患儿中的发生情况，并进一步分析PAX5基因缺失与ALL预后的相关性。方法用多重连接探针扩增（MLPA)技术检测2008年4月至2013年4月初诊无特殊重现染色体异常的B-ALL患儿及对照组（同期非血液系统疾病及肿瘤儿童）的PAX5基因拷贝数情况。根据有无PAX5基因缺失分为缺失组和非缺失组。结果86例患儿中18例（21%）发生了PAX5缺失。缺失组初诊时白细胞总数明显高于非缺失组（P=0.001）。Kaplan-Meier法分析显示：缺失组无病生存（DFS）率明显低于非缺失组（0.69±0.12 vs 0.90±0.04，P=0.017），但两组患儿的总生存（OS）率差异无统计学意义（P=0.128）。Cox法分析显示，PAX5缺失为影响DFS的不利因素（P=0.03）。结论 PAX5缺失为无特殊重现染色体异常B-ALL患儿DFS的独立危险因素。
关键词： PAX5 B-急性淋巴细胞白血病 多重连接探针扩增 预后 儿童 -
智力障碍儿童的亚端粒拷贝数变异检测
目的：应用多重连接探针扩增技术（MLPA ）检测亚端粒拷贝数变异，探讨遗传性智力障碍（ID）的发病机制。方法收集68例G-显带染色体核型分析结果正常的ID患儿，通过MLPA P036筛查亚端粒拷贝数变异。结果68例患儿中检出亚端粒拷贝数异常者7例（10%），均为缺失突变，其中1例患儿涉及2个亚端粒的缺失变异，另1例患儿涉及4个亚端粒的缺失变异。结论亚端粒拷贝数变异是遗传性ID的重要病因；MLPA可作为研究遗传性ID患儿发病机制的经济、有效的方法。
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儿童脊肌萎缩症的基因诊断
目的 对临床诊断疑似为脊肌萎缩症(SMA)的患儿进行运动神经元生存基因(SMN)缺失分析,通过基因诊断对SMA进行确诊.方法 收集2015年1月至2016年12月上海市儿童医院新生儿科及神经内科就诊的疑似SMA患儿29例,患儿就诊年龄11 d～14岁.采用多重连接探针扩增(MLPA)技术对上述患儿外周血DNA样本进行基因诊断.结果 15例存在SMA致病突变,疑似患儿的SMA基因诊断率为51.7％(15/29).其中8例为SMN1基因外显子7和外显子8纯合缺失;3例为SMN1基因外显子7和外显子8纯合缺失,SMN2基因外显子7拷贝数增加;4例为SMN1基因外显子7纯合缺失,外显子8杂合缺失.另外14例存在不直接致病的突变.按照SMA国际诊断标准,15例确诊患者中Ⅰ型5例,Ⅱ型5例,Ⅲ型5例,均占33.3％.其中Ⅰ型的5例患儿均为SMN1基因外显子7、8纯合缺失,仅有1例存在SMN2基因外显子7拷贝的轻度增加.结论 MLPA技术灵敏度较高,可作为SMA疑似患者首选的诊断方法,为SMA的明确诊断提供依据.
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采用多重连接探针扩增技术检测智力低下儿童的基因缺陷
目的 探讨原因不明智力低下儿童的发病与染色体亚端粒基因重组间的关系.方法 采用多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术检测30名原因不明的综合征性智力低下患儿的染色体亚端粒区域.结果 检测到5例患儿存在染色体亚端粒的基因缺失或重复突变,分别为4p缺失,21q重复,10p重复、4p缺失,15p重复,3p重复、9p缺失.结论 不明原因智力低下儿童的发病与染色体亚端粒基因重组密切相关.MLPA技术可以作为一种高效、特异的方法对智能障碍儿童进行基因缺陷筛查.
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多重连接探针扩增检测Williams综合征微缺失
MLPA是一种简便快速检测缺失及重复突变的方法,该技术弥补了荧光原位杂交技术的不足,可用于实验室对Williams综合征的快速检测,具有一定临床诊断价值.
关键词： 多重连接探针扩增 Williams综合征 微缺失 多态性标记 -
一个X连锁智力障碍家系的全外显子测序分析
目的 对一个非特异性智力低下患者家系进行临床表征及基因突变分析,为该家系遗传咨询提供依据.方法 运用多重探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)对先证者进行脆性X综合征筛查.在该家系中通过全外显子测序(whole exome sequencing,WES)分析以及Sanger测序验证,终对该家系进行遗传学咨询.结果 MLPA方法学排除先证者脆性X综合征.全外显子测序结果以及OMIM数据库分析结合先证者临床表型,推断ARX基因第1外显子c.88G＞T位点突变为该患者非特异型智力障碍致病基因.Sanger测序结果显示先证者母亲为ARX c.88G＞T突变的携带者,其姐姐及父亲均无此突变,两位舅舅为该位点半合子突变.结论 应用全外显子测序技术对X连锁非特异型智力低下家系进行诊断,明确了该家系的基因致病位点,有助于该家系的遗传咨询.
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应用单核苷酸多态性微阵列芯片检出一例DMD基因缺失突变胎儿
目的 探讨应用单核苷酸多态性微阵列芯片(single nucleotide polymorphism array,SNP array)检测胎儿DMD基因新发突变的价值.方法 对1例发育异常、无Duchenne/Becker肌营养不良症(Duchenne/Becker muscular dystrophy,DMD/BMD)家族史的胎儿的羊水样本进行染色体核型分析及SNP array检测,之后用多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)检测胎儿及其母亲DMD基因的缺失或重复突变.结果 胎儿的羊水染色体核型为46,XY,SNP array结果为arr hg19]Xp21.1(32 455 741-32 571 504)×1,缺失范围为116 kb,其断裂点分别位于DMD基因的第16及第30内含子,范围覆盖了第17～29外显子.MLPA检测提示胎儿DMD基因存在第17～29外显子的缺失突变,但胎儿母亲DMD基因未见异常.结论 胎儿DMD基因存在新发的第17～29外显子缺失突变,可能导致胎儿患BMD或DMD.对于致病基因不明、无家族病史及表型非特异的胎儿,应用SNP array检测可在一定程度上提高对于疾病的诊断效率.
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多重连接探针扩增技术及其应用
多重连接探针扩增是一种建立在PCR技术七的新型相对定量检测技术,该技术具有高效率、高分辨率、操作简便、设备要求低等诸多优势,目前已被广泛应用于基因片段缺失与重复、点突变及甲基化检测等相关疾病的分子生物学研究.其与基因芯片结合而建立的多重连接探针扩增微阵列芯片技术不但真正具备了高通量的检测能力,还使该技术的可靠性获得了很大的提高.本文就多重连接探针扩增的技术方法 、应用进展及目前还存在的局限性作一综述.
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应用多重连接探针扩增筛查高风险胎儿染色体亚端粒区变异
目的 探讨多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术在产前大规模筛查染色体亚端粒区变异中的应用.方法 选取1050例高风险胎儿,抽取羊水或脐带血,进行核型分析和MLPA检测.染色体亚端粒区变异结果用染色体微阵列验证.结果 核型分析发现染色体非整倍体23例,末端异常8例.MLPA检出了所有核型分析发现的染色体非整倍体和末端异常,并对4例染色体末端异常提供了更清晰的描述.此外,MLPA发现5例核型分析为正常的样本存在染色体亚端粒区变异,经微阵列验证2例为假阳性结果,假阳性率为0.19％.MLPA实际检出染色体亚端粒区变异11例,检出率为1.05％.结论 将MLPA技术应用于大规模筛查高风险胎儿的染色体异常,可以缩短检测周期,发现亚微观染色体变异,为遗传咨询和产前诊断提供依据.
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成骨不全症家系 COL1A1/2基因的大片段缺失突变分析
目的：在成骨不全症(osteogenesis imperfecta,OI)家系中进行 COL1A1/2基因内大片段缺失突变的鉴定。方法应用多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)方法对46例 PCR-测序未见 COL1A1/2基因突变的 OI 患者进行COL1A1/2基因大片段缺失突变检测,进一步应用荧光定量 PCR 或 Gap-PCR-测序法对 MLPA 方法检测到的缺失突变进行验证。结果通过MLPA 分析,在46例 OI 患者中检测到2例杂合性大片段缺失突变,先证者 A 为整个 COL1A1基因的杂合缺失,先证者 B 为COL1A2基因第20外显子的杂合缺失；荧光定量 PCR 结果证实先证者 A 携带整个COL1A1基因的杂合缺失突变；Gap-PCR、DNA 测序和凝胶电泳分析结果证实先证者 B 存在COL1A2基因内第17~23外显子的杂合缺失,断裂点区域有一个来自于5号染色体、长度637 bp 的 DNA 插入片段；先证者 B 家系成员突变验证显示其母亲为同一突变的杂合子。结论在中国人 OI 患者中发现了COL1A1和COL1A2基因的大片段缺失突变。本研究结果丰富了中国人群 I 型胶原相关 OI 致病基因突变谱,也为患病家系的产前基因诊断奠定了基础。
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中国西南地区170例杜氏/贝氏肌营养不良症dystrophin基因变异谱分析
目的 构建中国西南地区杜氏/贝氏肌营养不良症(DMD/BMD) dystrophin基因变异谱,探讨dystrophin基因型与临床表型之间的关系.方法 采用多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)对170例DMD/BMD患者进行dystrophin基因分析,其中3例怀疑点突变患者采用Sanger 测序分析基因突变位点.结果 Dystrophin基因突变MLPA检出率为72.94％,其中基因缺失、重复及点突变所占比例分别为62.35％ (106/170),8.82％ (15/170)及1.76％ (3/170).共发现64种不同类型突变,连续外显子44～55缺失突变型占全部缺失型患者的75.47％.大部分5'端断裂点集中在2个热区(主热区:内含子43～55;次热区:内含子1～20).基因型-表型分析显示DMD/BMD严重程度与基因缺失型或重复型无关,而与改变开放阅读框架型突变有关(r=0.640,P＜0.001).结论 连续外显子缺失或重复是dystrophin基因突变的主要类型,DMD/BMD严重程度与其改变开放阅读框架型突变有关.
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多重连接探针扩增及全基因组芯片分析孤独症患者SHANK3及UBE3A等热点基因拷贝数变异初步研究
目的 研究SHANK3,UBE3A等热点基因拷贝数变异(CNV)与孤独症的相关性.方法 对75名孤独症患儿及112名健康父母和30名正常对照进行研究,利用多重连接探针扩增(MLPA)及全基因组芯片重点对22q13区域(SHANK3基因)、15q11-13 (UBE3A,GABRB3基因)、15q13微缺失区域及CHRNA7基因、16p11微缺失区域等区域进行基因组DNA拷贝数变异检测.结果 ① MLPA分析显示,75名孤独症患儿有6名存在22q13区域的SHANK3基因第15外显子杂合缺失(8.0%,6/75),正常组缺失率为1.4%(2/142),两组间差异有统计学意义(P<0.05);②对6名SHANK3杂合缺失的患儿及6名正常对照进行全基因组芯片分析显示,孤独症患儿CNV变异总数和所涉及的染色体长度都远远高于对照组,在第1,9,15,16,21,22号染色体CNV变化较大.结论 高通量全基因拷贝数变异研究有助于孤独症研究,22q13及SHANK3基因可作为孤独症热点区域重点研究.
