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siRNA沉默Cdkl5对原代皮质神经元Mecp2及其下游靶基因表达的影响
目的 探讨CDKL5在Rett综合征中与MeCP2相互作用的机制.方法 体外培养孕18 dSD胎鼠皮质神经元,通过小RNA干扰技术(siRNA)敲低Cdkl5,分为干扰组(Cdkl5 shRNA)和对照组(control shRNA).用Real time-PCR及Western blot法评估Cdkl5在mRNA和蛋白水平被敲低的效率;Cdkl5表达降低后Mecp2和Mecp2相关的下游靶基因表达变化.对Cdkl5 shRNA转染后神经元用CCK8法检测吸光度值评估神经元活力;用real time-PCR和West-em blot法检测凋亡基因caspase3和凋亡活性蛋白cleaved-caspase3评估神经元凋亡状态.结果 干扰组与对照组比较,Cdkl5在mRNA水平下降73％,在蛋白水平下降75％(P＜0.05);Mecp2在mRNA和蛋白水平升高约2倍(P ＜0.05);BdnfⅪ在mRNA水平明显下降,Psd95在mRNA水平明显上升(P＜0.05).结论 建立稳定的Cdkl5基因敲低的原代皮质神经元模型,并初步提示CDKL5可能通过对MeCP2的调控诱导了下游靶基因的变化.
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Rett综合征患儿1例MECP2基因的突变鉴定及亲源性分析
目的 鉴定1例Rett综合征(RTT)女孩的致病性突变及进行突变的亲源性分析.方法 收集中山大学中山医学院医学遗传学教研室1例典型RTT女孩的临床资料并进行综合分析.提取患儿及其父母的外周血DNA;PCR扩增MECP2基因的全部4个外显子及剪接位点序列,对PCR产物进行直接测序;利用患儿MECP2基因突变位点附近的SNP位点进行等位基因特异性PCR扩增并测序,进行突变的亲源性分析.结果 患儿携带了MECP2 c.502C>T(p.R168X)杂合性突变;患者的双亲该位点均为正常的C碱基.患儿MECP2基因第3内含子存在1个SNP c.378-74C>T(即rs2071569),患儿的c.502C>T突变来自父源X染色体.结论 MECP2 c.502C>T(p.R168X)杂合性突变为该患儿的致病性突变,突变来自父源,该研究为基因型-表型的研究及遗传咨询提供了重要的依据.
关键词： Rett综合征 甲基化CpG结合蛋白2 MeCP2 基因突变 -
Rett综合征患儿MECP2基因型和表型关系研究
目的 寻找中国Rett综合征(RTT)患儿甲基化CpG结合蛋白2基因(MECP2)突变的基因型和表型之间的相互关系,为临床诊断和治疗提供帮助.方法 对126例经分子遗传学方法诊断的RTT患儿的临床表型参照Kerr等和Scala等评分标准进行打分,采用SPSS 12.0软件包进行统计分析.结果 分析MECP2突变类型、基因功能区和表型的关系显示,位于基因不同功能区的突变:甲基化CpG结合区(MBD)、转录抑制区(TRD)和C末端(CTS)对RTT表型的影响差异无统计学意义(P>0.05);不同突变类型:错义、无义、移码和大片段缺失突变对RTT表型的影响差异无统计学意义(P>0.05).分析MECP2突变类型和基因功能区共同对表型的影响显示:同位于MBD的无义和错义突变相比较,前者临床严重性评分高于后者,差异有统计学意义(P=0.016),而位于TRD的无义和错义突变临床严重性评分之间差异无统计学意义(P>0.05);位于MBD和TRD的错义突变的临床严重性评分之间差异无统计学意义(P>0.05),位于MBD和TRD的无义突变的临床严重性评分之间差异无统计学意义(P>0.05).分析MECP2常见突变类型和表型的关系显示:p.T158M、p.R168X、c.806delG和p.R255X对RTT表型总的影响差异无统计学意义(P>0.05),但在语言功能的受累程度上,以上4种突变之间差异有统计学意义(P=0.028),且语言能力受损的发生率差异也有统计学意义(P=0.019).结论 MECP2基因型和表型之间存在一些相互关系:位于MBD的无义突变病情较严重;在<5岁组中发生频率较高的4种突变对语言功能和语言能力受损发生率方面存在不同,其中p.R168X受损重.
关键词： Rett综合征 甲基-CpG-结合蛋白质2 基因型 表型 -
26例不典型Rett综合征MECP2基因的突变分析
目的了解不典型Rett综合征患儿MECP2基因的突变频率、突变类型、是否存在突变热点,寻找基因型和表型的相互关系.方法取26例不典型 Rett综合征患儿外周静脉抗凝血,采用Miller′s蛋白酶K氯化钠盐析法提取基因组DNA,采用PCR方法扩增MECP2基因的外显子及结合区,1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定目的PCR产物,然后进行DNA直接测序.DNA测序结果与人基因组序列(GeneBank AF030876)比较.结果 26例不典型Rett综合征患儿中有12例存在突变.突变类型包括错义突变,由于单个碱基缺失导致的移码突变和剪切位点的突变,其中错义突变为常见类型.c.397C>T为3例, c.473C>T、c.916C>T、c.806delG各为2例,c.397A>G、 c. 1005G> A、c.IVS2-2A>T各为1例.结论不典型Rett综合征患儿存在MECP2基因突变,R133C、T158M和R306C为其热点突变.基因突变类型和表型之间有一定的相关性.
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MeCP2基因热点突变分析在Rett综合征诊断中的应用
目的探讨MeCP2基因常见突变是否对Rett综合征临床诊断有帮助.方法对23例Rett综合征患儿,部分患儿家长和4名正常女性分别提取外周血基因组DNA.采用PCR方法扩增MeCP2基因第3外显子 nt22643～nt23022片段,限制性内切酶HphⅠ和Nla Ⅲ酶切分析T158M和R168X突变,6%聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检验酶切结果,突变点经DNA直接测序证实.结果 23例Rett 综合征患儿中4例有T158M突变,21例患儿中2例有R168X突变.在患儿双亲及正常女性对照均未发现以上2种突变.结论 T158M和R168X 2个突变在Rett综合征均较多发.PCR产物的限制酶分析,方法简便、快捷,有助于Rett综合征的临床诊断.
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Rett综合征患儿线粒体结构及功能缺陷的研究
目的探讨Rett综合征患儿线粒体损伤及其基因突变的基础.方法采用细胞融合技术将6例Rett综合征患儿及9例正常对照组儿童血小板与无线粒体DNA的ρ.细胞融合,用细胞色素氧化酶电镜细胞化学方法观察融合细胞线粒体超微结构,用极谱法测定融合细胞线粒体酶复合体活性及抗氰呼吸.结果3例Rett综合征患儿的融合细胞线粒体可见空泡改变.以琥珀酸为底物时,测定Rett综合征患儿的氧耗率较正常对照组降低34%(f=3.81,P＜0.01);以苹果酸+谷氨酸与维生素C+TMPD为底物时的氧耗率相比,差异无显著性(t=0.40,P＞0.05);Rett综合征患儿抗氰呼吸显著高于正常对照组(t=4.76,P＜0.001).结论Bert综合征患儿血小板存在线粒体结构和功能的异常改变,并因而造成患儿线粒体呼吸链氧自由基增多.线粒体DNA缺陷可能在Rett综合征发病机制中起作用.
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Rett综合征X染色体失活方式及失活X染色体起源研究
目的 研究Rett综合征(RTT)患儿和其母亲X染色体失活(XCI)方式,患儿失活X染色体来源,探讨RTT XCI与基因型、表型和遗传方式之间的关系.方法 对55例RTT患儿、53例RTT患儿的母亲、48例正常女性对照,提取其周围血白细胞DNA,经甲基化敏感性限制性核酸内切酶HpaⅡ消化,对消化前后雄激素受体(AR)基因片段行PCR扩增和基因扫描分析.结果 RTT患儿、RTT患儿母亲、正常对照AR基因片段杂合率分别为82%、77%、83%.RTT患儿XCI分布方式与患儿母亲及对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05),RTT患儿母亲与正常对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05).与患儿母亲及对照组相比,RTT患儿在50∶50～59∶41区段内患儿人数显著减少,差异有统计学意义(P＜0.05).RTT患儿非随机失活在XCI≥65∶35和≥80∶20范围与母亲及对照组相比人数增多,但差异无统计学意义(P＞0.05).在21例非随机失活的患儿中,18例倾向于父源X染色体失活,占85.7%,3例倾向于母源.在同一突变位点可以观察到各种XCI方式,T158M高度非随机失活率略高,R133C无高度非随机失活.非典型RTT比典型RTT高度非随机失活率增高,其中保留语言型与先天型相比,高度非随机失活率略高.结论 RTT患儿XCI分布方式与及母亲及对照组相比,完全随机失活人数显著减少,但在非随机失活人数上差异无统计学意义.母亲作为携带者传递致病基因不是RTT主要的遗传方式.RTT患儿非随机失活的X染色体主要起源于父亲.RTT患儿的XCI方式与临床表型有一定相关性,但XCI并不能完全解释表型.
关键词： Rett综合征 剂量补偿作用(遗传学) 基因型 表型 -
长片段PCR-DNA测序方法在Rett综合征诊断中的应用
目的 探讨利用长片段PCR-DNA测序方法检测Rett综合征(RTT)患儿MECP2基因突变的可行性及临床意义.方法 对40例临床诊断的RTT患儿用盐析法从外周血提取基因组DNA,采用长片段PCR同时扩增MECP2基因的第3和第4外显子,用1.5%的琼脂糖凝胶鉴定扩增目的片段的大小,进行DNA直接测序.结果 在40例RTT患儿中有33例患儿MECP2基因存在突变:无义突变16例;错义突变14例;缺失突变3例,其中有一例为314 bp的大片段基因缺失.突变以p.T158M为多见,占21%(7/33),其后依次为p.R255X,占12%(4/33),p.R168X和p.R106W各占9%(3/33),p.R270X和p.Y141X各占6%(2/33),p.R133C、p.D156H、p.F157L、p.P225R、p.Q244X、p.Q262X、p.R294X、p.R306C、P322L、c.1005delG、c.1005-1318del 314 bp和c.1127-1179del 53bp各占3%(1/33).结论 长片段PCR方法鉴定了83%(33/40)的RTT患儿存在MECP2基因突变,目前是一种简单、方便、快速、准确的基因诊断方法,能同时发现常见突变和基因大片段的缺失,有助于RTT的诊断.
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Rett综合征的临床特征及MeCP2的基因型与表型的关系研究
目的总结Rett综合征(RTT)的临床特点,探讨甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)基因突变型与表型的关系.方法北京大学第一医院儿科1987年以来诊断的RTT66例,每1～2年对本组患儿进行1次临床随访,并观察左旋肉碱的治疗反应.应用PCB、测序方法对39例患儿进行突变基因分析.结果患儿3～38个月起病,59例(89%)患儿于7个月～6岁丧失手的功能,66例(100%)患儿1～5岁出现手的刻板动作,56例(85%)患儿11个月～8岁语言完全丧失,21%的患儿于2岁9个月～15岁丧失原已获得的行走能力.头围小、惊厥、呼吸节律异常、咬牙、脊柱侧凸或后凸均很常见.左旋肉碱治疗17例,8周后6例症状改善.39例进行MeCP2基因分析者中有25例(64%)发现突变,其中2例无义突变C502T(氨基酸改变R168X)患儿均死亡,2例C397T(氨基酸改变R133C)和1例A398T(氨基酸改变R133H)突变者均保留语言.结论RTT特征性的表现为头围增长缓慢,手的失用与刻板动作,语言倒退,左旋肉碱可以改善部分患儿的临床症状.MeCP2基因型与表型之间有一定的相关性.
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散发Rett综合征患儿新生MECP2突变亲源鉴定和X染色体失活15例分析
目的 了解Rett综合征(RTT)患儿致病基因甲基化CpG结合蛋白2基因(MECP2)的突变亲源起源和X染色体失活(XCI)的影响.方法 选取15例临床典型RTT并经DNA测序证实存在新生MECP2突变和一个已知单核苷酸多态性位点的患儿,分别对患儿及父母外周血DNA进行等位基因特异性PCR扩增,通过DNA测序和凝胶电泳判定患儿突变的亲源起源;用雄激素受体基因(AR)的三核苷酸多态性进行基因型分析判定XCI是否发生偏斜和失活X染色体的亲源性.结果 15例RTT患儿中13例是由于C→T碱基转换引起的点突变,2例为移码突变.13例点突变患儿的突变全部来自父源,2例移码突变中1例突变来自父源,另外1例来自母源.突变来自父源的RTT患儿占选取病例总数的93.3%;XCI分析除2例由于无AR多态性信息无法判定外,其余13例中有8例XCI为随机失活,5例为非随机失活.5例非随机失活的患儿均表现为父源x染色体优先失活.结论 散发RTT患儿新生MECP2突变几乎全部来自其父源X染色体,XCI多为随机失活,部分非随机失活均表现为其父源X染色体优先失活.
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发育中Wistar大鼠大脑皮层甲基化结合蛋白-2基因表达变化
目的:研究甲基化结合蛋白-2(methyl-CpG-binding protein 2,mecp2)基因在发育中正常Wistar大鼠大脑皮层表达水平的变化.方法:应用实时定量PCR(real-time PCR),Northern印迹杂交对mecp2基因在正常Wistar大鼠发育的不同阶段:胚胎第15天(E15)、第17天(E17)、第19天(E19)、出生当日(P0),生后第7天(P7)、生后第14天(P14)、生后第28天(P28),成年期大鼠mRNA的表达水平进行定性、定量分析;应用Western印迹杂交对MeCP2的表达水平进行半定量分析.结果:mecp2基因是在正常Wistar大鼠大脑皮层中表达的mRNA,约为10kb.从胚胎至成年期的发育过程中,mecp2基因mRNA的表达虽有波动,但差异无显著性.mecp2基因在正常Wistar大鼠大脑皮层中仅表达一种MeCP2,相对分子质量为75 000.在不同发育阶段其表达水平表现为,胚胎E15表达水平低,自胚胎E19始至成年期MeCP2表达水平较E15明显增高.生后第7日至成年期,各时间点间表达水平的变化差异没有显著性.结论:随着正常Wistar大鼠大脑皮层神经元的发育成熟,MeCP2的表达水平逐渐增高,说明MeCP2对神经元的成熟有重要作用,并可能与维持神经元的成熟状态有关.
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Rett综合征的致病基因彻CECP2的研究进展——MECP2的基因结构、功能及调控基因
Rett综合征(Rett syndrome,RTT)是一种神经系统发育异常性疾病,主要累及女孩,是导致女性智力低下的主要原因之一.女孩发病率大约为1:10 000～1:15 000.典型RTT的临床特征为:出生后6～18个月生长发育基本正常,随后出现神经发育停滞或倒退,丧失已获得的技能(如手的功能、语言等),头围增长缓慢,呼吸异常,出现手的刻板动作(如搓手、绞手、吃手等),伴有孤独症样行为,此外,惊厥发作也是常见症状之一,到疾病后期还可能出现骨骼改变、脊柱侧弯及强直等~([1-2]).
关键词： Rett综合征 甲基-CpG-结合蛋白质2 基因 突变 -
Rett综合征1例报道
现将1例Rett综合征报道如下:1 临床资料患儿,女,1岁7个月.因智能动作发育倒退.伴双手拧绞样动作8个月入院.G1P1,足月顺产,无外伤史.母乳喂养,满月会笑,3个月翻身,6个月会坐并能分辨陌生人、熟人,7个月可发"打、拿"等单音和"爸爸、妈妈"复音.
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Rett综合征患儿甲基化CpG结合蛋白2基因和细胞周期依赖性激酶样5蛋白基因的突变
目的 了解Rett综合征(RTT)患儿甲基化CpG结合蛋白2基因(MECP2)和细胞周期依赖性激酶样5蛋白基因(CDKL5)突变及热点突变,建立适合临床诊断的检测方法和策略.方法 对1987至2007年北京大学第一医院儿科神经专业组诊断的177例散发RTT患儿抽取外周抗凝血提取DNA,用PCR-DNA测序方法对MECP2的全部外显子进行突变筛查,如未发现突变,用多重连接依赖的探针扩增(MLPA)法进行基因剂量分析.对MECP2未发现突变的患儿用变性高效液相色谱法(DHPLC)进行CDKL5突变筛查.结果 在177例患儿中发现145例MECP2突变,1例CDKL5突变,总的突变率82%.MECP2突变中错义突变频率高(39%);其后依次为无义(28%)、移码(17%)和大片段缺失突变(14%).所有突变中8种常见突变依次为p.T158M(13%)、p.R168X(12%)、c.806delG(7%)、p.R255X(6%)、p.R270X和p.R133C各(5%)、p.R306C(4%)、p.R106W(3%).11%的患儿存在一个或多个外显子的缺失.结论 中国RTT患儿MECP2突变谱和国外报道相似,有热点突变.c.806delG是中国人群特有的一个热点突变.
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线粒体损伤在散发性Rett综合征发病中的作用
目的探讨线粒体损伤在Rett综合征(RTT)发病中的作用.方法采用细胞融合技术将6例Rett综合征患儿及9例正常对照血小板与无线粒体DNA的ρ°细胞融合,用极谱法评价融合细胞氧自由基水平,用流式细胞计测定细胞凋亡率,应用电镜和TUNEL观察细胞凋亡.组间比较采用t检验.结果 RTT患儿组抗氰呼吸较正常对照组增高23%(t=4.76,P<0.01),应用100 μmol/L的H2O2刺激融合细胞6 h后,细胞凋亡率正常组为(3.6±1.1)%,RTT患儿组为(9.9±2.7)%,显著高于正常对照组(t=6.30,P<0.01),电镜和TUNEL均证实凋亡.结论线粒体DNA转移后RTT患者融合细胞线粒体呼吸链氧自由基水平增多,RTT融合细胞对过多氧自由基的凋亡易感性增高,线粒体损伤在RTT发病中可能起着一定作用.
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FOXG1基因新发突变致先天性Rett综合征 变异型一例报告
目的 对FOXG1基因突变所致先天性Rett综合征变异型患儿临床表现进行汇总归纳,为该疾病的诊断治疗提供参考.方法 总结1例临床诊断为先天性Rett综合征变异型患儿的病例资料,提取患儿及其父母外周血DNA,采用靶向基因高通量测序技术检测与患儿症状相关的致病基因,应用sanger测序进行验证,同时行染色体微阵列检测除外染色体微缺失、微重复等情况.结果 该患儿位于14q12的FOXG1基因有c.506dupG,p.G169Gfs*286杂合突变,其父母均为野生型,经查询HGMD、Clinvar及dbSNP数据库,未见相关报道.该病例明确诊断先天性Rett综合征变异型,其突变位点为新突变.结论 对于符合先天性Rett综合征变异型表现的病例,建议行FOXG1基因突变检查,并对部分可预知的功能障碍进行预防性治疗.
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儿童散发Rett综合征突变基因的亲源分析
Rett综合征(Rett syndrome,RTT)是一种严重影响儿童精神运动发育的疾病,是女性严重智力低下的重要原因之一,男童罕见,女童患病率为7/10万～10/10万[1].1999年Amir等[2]确定位于Xq28的甲基化CpG 结合蛋白2基因(methyl-CpG-binding protein 2,MECP2)是RTT的致病基因.RTT为X连锁显性遗传,但患者中99%以上的MECP2基因突变为新生突变,患者父母检测不到相应的基因突变[3].目前,研究者们试图积累更多病例,探讨RTT遗传机制和突变的亲源起源以满足患者家庭遗传咨询的需要.本研究对在我院临床诊断典型RTT并MECP2基因检测阳性的1例女性患者进行了突变亲源性的鉴定.
关键词： Rett综合征 突变 甲基化CpG结合蛋白2基因 单核苷酸多态性位点 亲源 -
Rett综合征的基因突变检测
Rett 综合征(Rett syndrome,RTT)多发生在儿童早期,主要表现为早期发育正常,6～18个月后出现进行性发育障碍,手部出现技巧性动作障碍,语言功能部分或完全丧失.患者几乎均为女性,但近年也有男性病例报道[1,2],患病率约为1/15 000～1/10 000[3].RTT是一种性联遗传神经系统退行性疾病,呈X染色体显性遗传,1999年Amir等[4]确定位于染色体Xq28的MECP2基因是RTT的致病基因以来,国外发现60%～90%典型和40%非典型RTT患者存在各种基因突变[5,6],北京大学第一医院诊断的RTT患者中,典型患者该基因的突变检出率为84.3%～87.9%,不典型患者的突变检出率达57.1%[7,8].建立基因测定辅助临床早期确诊RTT患者是十分必要的,本文报道2例我院儿科神经专科诊断的散发典型RTT患者及父母基因突变检测方法和结果.
关键词： Rett综合征 甲基CpG结合蛋白质2 基因突变 -
Rett综合征与MECP2基因
Rett综合征是一种严重影响儿童精神运动发育的神经遗传病,诊断主要依靠国际上根据临床表现制定的标准,包括典型和非典型Rett综合征两类.该病的遗传方式尚无定论.致病基因是位于染色体Xq28的MECP2基因,编码甲基化结合蛋白2.推测致病机制为MECP2基因突变导致蛋白结构和功能异常,使胚胎发育时期应当转录静止的基因继续转录,而这种"转录噪音"对神经系统的生长和发育具有致病作用.典型Rett综合征患儿MECP2基因主要有8种热点突变.MECP2基因作用的下游靶基因尚不清楚.
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儿童Rett综合征22例临床特征分析
目的 总结Rett综合征(RTT)临床特点.方法 对复旦大学附属儿科医院神经科2004年2月至2007年9月诊断的22例RTT( 19例女性、3例男性)患儿临床资料及辅助检查结果进行分析.结果 19例女性患儿临床特征:15例符合典型RTT诊断标准,4例疑似不典型RTT.18例为临床Ⅱ期,1例为临床Ⅲ期.89.5％( 17例)于6～18个月起病.所有病例均在1～3岁龄时出现单一、无目的的手的刻板动作.68.4％(13例)有夜间磨牙征,89.5％( 17例)诊断时头围低于同龄正常均值.14例在发病前获得语言能力,语言倒退年龄为10个月至2岁,其中11例(57.9％)语言开始倒退后完全丧失表达能力,2例(11.0％)保留2、3个字语言表达(语言未完全丧失),1例保留眼神与手及其他肢体交流；5例从未获得语言能力.14例获得行走能力,但步态不稳、易摔跤,随访中未丧失行走能力.11例(57.9％)有惊厥发作,抗惊厥治疗效果良好.19例进行头颅影像学检查,16例未发现异常、2例有脑发育不良、1例基底节钙化.3例男性均符合典型RTT诊断标准.结论 本组均符合RTT诊断标准,但表型各异,探讨其基因型和表型间的关系应是今后研究方向.
