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结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6家族其他蛋白抗原的研究进展
目前结核分枝杆菌的致病机制和宿主的防御机制尚不十分清楚,结核分枝杆菌蛋白抗原生物学特性的研究有助于该问题的阐明,将为结核病疫苗、免疫诊断试剂和新药的开发奠定基础.早期分泌抗原靶6(ESAT-6)家族蛋白是一类小分子蛋白,呈螺旋状结构,它们通过ESAT-6分泌系统(ESAT-6 secretion system,ESX)分泌到细胞外.该家族共有23个成员(EsxA～W),其在基因组上相邻排列的2个蛋白编码基因形成11个类操纵子结构的基因对.该家族蛋白参与宿主与致病菌之间的相互作用,是人免疫系统识别的优势抗原,大多数是T细胞优势抗原,在结核分枝杆菌致病机制和机体的免疫保护机制方面起关键作用.鉴于EsxA和EsxB的研究概况国内外报道较多,而其他ESAT-6家族成员研究报道较少.因此,笔者着重概要地介绍ESAT-6家族其他成员的国内外研究进展情况,为进一步的深入研究和应用奠定基础.
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转化生长因子β1及其信号转导分子Smad 2在病变肾小球中的表达及其意义
目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)及其信号转导分子Smad 2在肾小球肾炎中的表达及其意义.方法以11例肾小球轻微病变为对照组, 对各种不同组织学类型的IgA肾病40例、膜性肾炎10例、硬化性肾炎11例的肾穿刺活检标本,分别行原位分子杂交检测肾小球Smad 2 mRNA的表达和免疫组织化学ABC方法观察TGF-β1、Ⅳ型胶原及纤连蛋白在肾小球中的染色强度,并对其检测结果作图像分析处理.结果除轻微病变型IgA肾病的Smad 2 mRNA表达外,其他病理类型肾炎中病变肾小球TGF-β1蛋白和Smad 2 mRNA的表达均高于对照组,且两者在肾小球中的表达与Ⅳ型胶原、纤连蛋白在肾小球中的沉积呈正相关.结论 TGF-β1及其信号转导分子Smad 2可能参与了病变肾小球细胞外基质的过量积聚,在肾小球硬化过程中起重要作用.
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HBXIP 过表达在胃癌预后评估中的作用及意义
目的探讨乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白（ HBXIP）在胃癌细胞株AGS中的定位及其过表达与胃癌患者临床病理参数及预后的关系。方法采用免疫荧光技术检测HBXIP在胃癌细胞株AGS的定位，采用免疫组织化学EnVision法检测HBXIP在97例胃癌组织、41例癌旁非瘤组织和13名正常胃黏膜上皮组织中的表达，并分析HBXIP过表达与胃癌患者病理参数及预后评估之间的关系。结果免疫荧光、免疫组织化学结果显示HBXIP主要定位于胃癌细胞的细胞质，免疫组织化学结果显示 HBXIP 蛋白在胃癌组织中表达阳性率和强阳性率分别为68.0％（66／97）和49.5％（48／97），显著高于癌旁非瘤组织（48.8％，20／41；36.6％，15／41）和正常胃黏膜上皮组织（2／13，1／13；P值均＜0.05）；卡方检验结果显示，HBXIP表达水平与胃癌患者分化程度、有无淋巴结转移密切相关（P值分别为0.007和0.041）。 Kaplan-Meier生存分析表明，HBXIP高表达胃癌患者总生存期显著低于HBXIP低表达的患者（ P＝0.015）。结论 HBXIP表达主要定位于细胞质，表达水平与胃癌的发生发展及预后密切相关。 HBXIP表达水平可成为预测胃癌患者预后的重要指标。
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转染Smad7基因的大鼠肾系膜细胞基质金属蛋白酶2及其组织抑制因子2表达的改变
目的通过对大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell,MsC)转染Smad 7基因,观察转染阳性细胞克隆基质金属蛋白酶2(MMP-2)及其组织抑制因子2(TIMP-2)表达的改变,以进一步阐明Smad 7阻断肾组织纤维化过程的作用机制.方法经脂质体介导将含有Smad 7重组表达质粒转染大鼠MsC,用G418筛选及Western印迹分析、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法鉴定;又分别采用Western印迹分析、酶谱分析法和RT-PCR法,检测转染阳性细胞克隆MMP-2和TIMP-2表达改变.结果成功建立高表达Smad 7的阳性MsC克隆(S-22,S-26),并证实其MMP-2蛋白分泌和酶活性均明显升高,而TIMP-2 mRNA及其蛋白的表达则被明显抑制.阳性MsC克隆S-22,S-26细胞分泌MMP-2比对照组高约3.8倍(P<0.01);S-22与S-26细胞TIMP-2蛋白表达约为对照组48%(P<0.05).结论 Smad 7可能通过增强肾组织内MMP-2酶活性和抑制TIMP-2的生成而起到减轻肾组织纤维化进展的作用.
关键词： 转染 明胶酶A 金属蛋白酶2组织抑制剂 肾小球膜 DNA结合蛋白质类 -
WWOX和p73基因在急性淋巴细胞白血病中表达的研究
目的 研究含有氧化还原酶的WW域(WW domain containing oxidoreductase,WWOX)和p73基因在急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)中异常表达的临床意义及其机制.方法 采用病例对照研究,收集2010-2011年广西医科大学第一附属医院收治的ALL患者骨髓样本48份,其中包括初诊患者32例、缓解患者11例、复发患者5例；收集同期非白血病患者骨髓样本31份作为对照组.抽取骨髓3 ml,EDTA抗凝,1 ml骨髓样本采用离心柱法立即提取RNA,取纯度在1.8～2.0范围内的产物逆转录后进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),检测WWOX和p73基因mRNA的表达情况；2 ml骨髓样本采用离心柱法提取DNA,取纯度在1.7 ～1.9范围内的产物进行甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR),检测WWOX基因启动子区和p73基因第1外显子的甲基化情况.不同组别间甲基化状态的比较采用x2检验或Fisher确切概率法.结果 31份对照组标本中,WWOX与p73基因mRNA阳性表达率均为94.00％(29/31).48份ALL标本中,WWOX mRNA阳性表达率为48.00％(23/48),低于对照组,差异有统计学意义(x2=17.434,P =0.000)；其中初诊组为34.38％(11/32),低于缓解组的90.91％(10/11),差异有统计学意义(x2=10.471,P=0.001).p73基因mRNA阳性表达率为56.00％( 27/48),低于对照组,差异有统计学意义(x2=12.697,P=0.000)；其中初诊组为43.75％( 14/32),低于缓解组的90.91％(10/11),差异有统计学意义(P=0.012).31份对照组标本中,WWOX与p73基因均未见甲基化现象(0/31).48份ALL标本中,WWOX基因甲基化率为44.00％( 21/48),明显高于对照组,差异有统计学意义(x2=18.473,P=0.000)；其中初诊组为56.25％ (18/32),高于缓解组的9.09％ (1/11),差异有统计学意义(P=0.012);p73基因甲基化率为35.00％(17/48),明显高于对照组,差异有统计学意义(x2=13.990,P=0.000),其中初诊组为46.88％( 15/32),高于缓解组的9.09％ (1/11),差异有统计学意义(P=0.033).WWOX与p73基因mRNA阳性表达率均与各自基因甲基化状态呈负相关(r=-0.678、-0.577,P=0.000).结论 WWOX与p73基因的甲基化可能导致基因的沉默,使其mRNA减少或缺失；WWOX与p73基因甲基化的检测可能对ALL的诊断和疗效评估有一定意义.
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原发性胆汁性肝硬化患者lncRNA表达谱芯片分析及功能研究
目的 分析原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者外周血单个核细胞(PBMC)中长链非编码RNA(lncRNA)表达谱,为PBC的发病机制、临床诊断和治疗提供新的方向.方法 收集PBC及健康对照组外周抗凝血各30份,分离PBMC,从中各选取4份进行lncRNA表达谱芯片测定,并用逆转录PCR(RT-PCR)验证芯片结果.对芯片结果进行生物信息学分析,如 Cis/Trans 靶基因分析、Gene ontology(GO)分析、Pathway分析和共表达网络预测,并设计小干扰RNA(siRNA)干扰lncRNA的表达,进行靶点验证.结果 相对于健康对照组,PBC患者PBMC中共发现749个异常表达的lncRNA, 230个异常表达的信使RNA(mRNA).PBC组核受体(NR4A3)基因表达水平下调78%,而在NR4A3基因下游20000 bp左右的lncRNA linc-pbc的表达上调2.56倍.转染针对linc-pbc 的siRNA后, PBMC中linc-pbc的水平下降,而NR4A3的mRNA表达水平及蛋白质水平均上调,叉头状转录因子(FOXP3)的表达也上调.结论 linc-pbc或许通过招募多梳蛋白抑制性复合物(PRC2),使NR4A3基因启动子区甲基化,下调NR4A3基因的表达水平,使其调控靶基因转录的活性降低,导致下游的靶基因FOXP3的表达下降,进而引起外周血及肝组织局部具有免疫抑制功能的调节性T细胞(Treg)细胞数量减少,打破机体免疫耐受平衡,促进PBC的发生和发展.
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卵巢癌患者RUNX3基因启动子区甲基化状态分析
目的 探讨人RUNX3(runt-related transcription factor 3 gene)基因在上皮性卵巢癌组织中的甲基化状态及其在卵巢癌发生发展中的作用.方法 用甲基化特异性PCR(MSP)检测32份卵巢癌组织、32份癌旁组织、36份卵巢良性上皮性肿瘤组织及10份正常卵巢组织中RUNX3基因启动子CpG岛的甲基化频率.培养2种卵巢癌细胞系(3AO,SKOV3),MSP法检测加入5-氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine)前后RUNX3基因在卵巢癌细胞系中的甲基化水平.逆转录(RT)-PCR检测加入5-aza-2'-deoxycytidine前后卵巢癌细胞株中RUNX3 mRNA的表达改变,及上述各卵巢组织中RUNX3基因mRNA的表达情况.结果 卵巢癌标本中53.1%(17/32)发生了RUNX3基因启动子甲基化;癌旁组织RUNX3基因甲基化率为37.5%(12/32);良性卵巢肿瘤组织中RUNX3基因甲基化率为16.7%5(6/36);10份正常卵巢组织均未检测到RUNX3基因甲基化.卵巢癌组织中甲基化率与临床分期、细胞分化程度无相关性.卵巢癌与良性卵巢肿瘤和正常组织间的甲基化率的差异有统计学意义(分别x2=10.060,x2=8.925,均P＜0.05).2株卵巢癌细胞系中均发生了RUNX3启动子甲基化,经5-aza-2'deoxycytidine处理细胞株后,可部分或完全逆转RUNX3基因启动子甲基化.RUNX3基因mRNA的表达在卵巢癌中为16.7%(6/32);癌旁组织为28%(9/32),良性肿瘤中为72%(26/36),正常组织中为80%(8/10),其表达在卵巢癌与良性肿瘤和正常卵巢组织中的差异有统计学意义(分别x2=19.443,x2=12.862,均P＜0.05).经5-aza-2'deoxycytidine处理细胞株后,各细胞株RUNX3基因mRNA较加药前均有不同程度的表达增加.结论 卵巢癌组织中RUNX3基因启动子有较高的甲基化率,且在卵巢癌的发生发展中起重要作用;有可能成为卵巢癌早期诊断的分子生物学指标.RUNX3基因甲基化与其mRNA表达密切相关,是基因表达调节的重要方式之一,这种改变可被甲基化酶抑制剂所逆转.
关键词： 卵巢肿瘤 DNA结合蛋白质类 转录因子 启动区(遗体学)DNA甲基化 -
胃癌CD4+CD25highFoxp3+调节性T淋巴细胞数量和分布及Foxp3基因表达与肿瘤分期的相关性
目的 研究胃癌患者CD4+CD25highFoxp3+调节性T淋巴细胞(Treg)的存在数量、分布情况,及其功能基因Foxp3的表达变化与胃癌临床国际肿瘤淋巴转移分类(TNM)分期的关系.方法 用四色流式细胞术以Foxp3-FITC/CD25-PE/CD4-PerCP/CD3-PC7抗体组合分析20名健康对照者及47例胃癌患者(临床TNM分期Ⅰ期11例、Ⅱ期18例、Ⅲ期10例、Ⅳ期8例)外周血、腹腔积液、肿瘤组织浸润淋巴细胞(TIL)及癌旁淋巴结中CD4+CD25highFoxp3+Treg的数量及分布情况.实时荧光定量PCR技术检测Treg Foxp3 mRNA表达水平.结果 胃癌患者外周血CD4+CD25highFoxp3+Treg占CD4+T淋巴细胞的百分比为(8.03±3.47)%,高于正常健康对照组(5.83±2.93)%,差异具有统计学意义(P＜0.05).胃癌患者腹腔积液、肿瘤浸润淋巴细胞、癌旁淋巴结中Treg占CD4+T淋巴细胞比例均高于外周血,差异有统计学意义(分别为P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01).胃癌组织局部TIL和癌旁淋巴结中Treg的Foxp3平均荧光强度显著高于外周血和腹腔积液(P＜0.05).Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者Treg比例分别为(5.72±1.95)%、(6.45±2.23)%、(9.58±3.13)%、(11.70±2.30)%,这提示Treg与肿瘤TNM分期显著相关(r=0.784,P＜0.01).胃癌患者外周血单个核细胞Foxp3基因mRNA表达水平明显高于健康对照组(P＜0.01).Foxp3基因表达水平与胃癌TNM各分期呈显著相关性(r=0.623,P＜0.05).结论 胃癌患者CD4+CD25highFoxp3+Treg的比例升高,其增高程度与肿瘤临床分期呈显著正相关.胃癌患者外周血和癌组织局部Treg的数量、分布情况及特异性转录因子Foxp3的表达强度均有所不同,提示肿瘤局部免疫抑制功能增强,这可能是产生肿瘤免疫抑制的重要机制,CD4+CD25highFoxp3+Treg将来可作为胃癌患者病情进展的重要判断指标之一.
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CD127用于特异性识别调节性T淋巴细胞的方法建立及临床应用评价
目的 建立用膜表面标志CD4+ CD25high CD-/low127界定调节性T淋巴细胞的方法,并评价其临床应用意义.方法 五色流式细胞术以Foxp3-FITC/CD127-PE/CD4-PerCP/CD25-APC/CD3-PC7抗体组合鉴定调节性T淋巴细胞,分选CD4+CD25highCD-/low127细胞鉴定Foxp3 mRNA和蛋白水平的表达情况,比较CD-/low127与Foxp3+界定调节性T淋巴细胞的相关性.用该膜表面标志分析20名健康对照者外周血及35例胃癌患者不同部位CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(Treg)细胞的分布特点及意义.结果 用CD4+CD25highCD-/low127界定调节性T淋巴细胞的Foxp3蛋白表达率为87.1%,Foxp3 mRNA高表达.用膜表面抗原CD4+CD25highCD-/low127界定调节性T淋巴细胞与CD4+CD25highFoxp3+具有相关性(r=0.985,P＜0.01).胃癌患者外周血CD25highCD-/low127调节性T淋巴细胞占CD4+T淋巴细胞的比例为(8.67 ±3.52)%,高于健康对照组[(5.12±2.46)%,t=2.542,P＜0.05].胃癌患者腹腔积液、肿瘤浸润性淋巴细胞、癌旁淋巴结中CD4+CD25highCD-/low127调节性T淋巴细胞占CD4+T淋巴细胞比例均高于外周血(分别为t=2.357,P＜0.05;t=6.174,P＜0.01;t=5.481,P＜0.01).胃癌Ⅰ期+Ⅱ期患者外周血CD25high CD-/low127Treg细胞占CD4+T淋巴细胞的比例为(6.04±2.31)%,Ⅲ期+Ⅳ期患者为(10.16±2.29)%,其分期差异具有显著统计学意义(t=2.473,P＜0.05).结论 CD4+CD25highCD-/low127抗体组合可用于鉴定调节性T淋巴细胞.胃癌患者CD4+CD25highCD-/low127调节性T淋巴细胞的比例升高,且增高程度与肿瘤临床分期相关.
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STAT3和Cyclin D1在胰腺癌中的表达及其临床意义
目的探讨信号转导和转录激活因子-3(STAT3)、磷酸化STAT3(PSTAT3)及Cyclin D1的蛋白在胰腺癌中表达情况及活化STAT3的蛋白表达与胰腺癌临床病理特征的关系.方法用免疫组化法检测41例手术切除的胰腺癌组织和10例正常胰腺组织中STAT3、PSTAT3、Cyclin D1的蛋白表达.结果在41例胰腺癌标本中有31例(75.6%)STAT3、29例(70.7%)PSTAT3和25例(61.0%)Cyclin D1的蛋白表达阳性,明显高于正常胰腺组织.STAT3主要在细胞质表达,STAT3和Cyclin D1主要在细胞核内表达.PSTAT3和Cyclin D1蛋白的阳性表达呈正相关(P < 0.001).PSTAT3在临床分期较晚和有淋巴结转移的胰腺癌中呈高表达(P < 0.05),yclin D1的表达与淋巴结转移有关(P < 0.05).结论本研究结果表明胰腺癌组织中存在STAT3、PSTAT3和Cyclin D1的过表达,并与临床病理分期和淋巴结转移有关,STAT3过表达与Cyclin D1的表达呈正相关,提示PSTAT3可能通过上调Cyclin D1表达,在胰腺癌的发生发展中起重要作用.
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卡介苗菌MDP1基因敲除技术的研究
目的在卡介苗中建立基因敲除技术.方法通过分别设计两对引物,将靶基因[DNA结合蛋白1(MDP1)基因]通过聚合酶链反应(PCR)的方法扩增得到2个片段,分别插入pKO质粒中,构建得到基因敲除质粒pKO-MDP1,电转入至卡介苗菌株细胞内并与BCG基因组中的MDP1基因同源交换,筛选出敲除菌株,并测其生长曲线.结果通过2次PCR筛选和1次蔗糖反筛选后得到的、并在含潮霉素培养基上不能生长的菌株为MDP1基因敲除菌株,对敲除菌株与原代菌株每12 h测定其菌液的600 nm处吸光度(A600)值,连续16 d.两者的生长速度曲线呈现"S"形,两者之间的生长速度未见明显差别.结论 pKO质粒可作为基因敲除有用的质粒载体,MDP1基因可能是影响BCG生长的因素之一,但不是惟一的因素.
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噬菌体展示技术在HBV前-S1蛋白反式激活基因1启动子DNA的结合蛋白筛选中的应用
目的 应用噬菌体展示技术筛选HBV前-S1蛋白反式激活基因1(PS1TP1)的启动子DNA结合蛋白,进一步阐述PS1TP1在慢性乙型肝炎发病机制中的作用.方法 根据GenBank中的PS1TP1启动子DNA序列设计引物,运用PCR技术以人基因组DNA为模板,扩增获得PS1TP1启动子的DNA片段,并通过亚克隆方法构建真核报告载体pCAT3-PS1TP1p后转染HepG2细胞系,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以验证所获得的DNA片段具有启动子活性;将PS1TP1启动子DNA片段进行固相化,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,将所获得的噬斑裂解液进行PCR扩增,测序后进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索.结果 pCAT3-PS1TP1p瞬时转染的HepG2细胞中CAT表达活性是对照组(pCAT3-Basic空载体)的32.9倍,是pCAT3-promoter的4.2倍,提示所获得的DNA片段具有启动子活性;经4轮筛选共得到阳性克隆18个,经PCR扩增、测序,并经生物信息学分析后筛选出PS1TP1的启动子DNA结合蛋白编码基因共15个.结论 PCR扩增后所获得的PS1TP1启动子DNA片段具有顺式激活下游基因表达的作用,为研究PS1TP1启动子功能奠定了基础;噬菌体展示筛选结果提示PS1TP1可能参与了细胞周期调节、MAPK信号转导通路,并且有可能在辅助性T细胞亚群的发育和B细胞分化过程中发挥作用.
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ERCC1基因多态性与卵巢上皮性癌患者铂类药物化疗敏感性及预后的关系
目的 探讨切除修复交叉互补基因1(ERCC1)的单核苷酸多态性(SNP)与卵巢上皮性癌(卵巢癌)患者铂类药物化疗敏感性和预后的关系.方法 通过Haploview软件(Version4.2;http://www.broadinstitute.org)筛选出ERCC1基因的6个标签SNP(tagSNP)位点,即rsl1615、rs3212986、rs735482、rs3212955、rs12610134、rs3212958位点,采用单碱基延伸(Snapshot)法检测220例卵巢癌患者ERCC1基因6个tagSNP位点的基因型.比较铂类药物敏感(147例)和不敏感(73例)、复发(135例)和未复发(85例)、死亡(92例)和存活(128例)患者的ERCC1基因6个tagSNP位点的基因型频率;并对携带ERCC1基因6个tagSNP位点不同基因型的卵巢癌患者的预后进行比较,评价患者预后的指标包括疾病无进展生存时间(PFS)和总生存时间(OS).结果 ERCC1基因rs1615位点CC、CT、TT基因型频率,铂类药物敏感(分别为53.1％、45.6％、1.4％)与不敏感(分别为52.0％、35.6％、12.3％)、复发(分别为54.8％、37.0％、8.2％)与未复发(分别为49.4％、50.6％、0)、死亡(分别为51.1％、39.1％、9.8％)与存活(分别为53.9％、44.5％、1.6％)患者分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);与携带CC基因型的卵巢癌患者相比,携带TT基因型患者的铂类药物化疗敏感性明显降低(OR =6.22,95％CI为1.12 ～34.42).log-rank分析显示,ERCCl基因rs11615位点CC、CT、TT基因型频率与卵巢癌患者的PFS和OS均明显相关(P ＜0.01);Cox比例风险回归模型分析表明,与携带CC基因型的卵巢癌患者相比,携带TT基因型患者的PFS(分别为21.1、8.6个月;HR =2.19,95％ CI为1.14 ～4.22,P=0.009)和OS(分别为28.5、19.3个月;HR =2.22,95％ CI为1.06 ～4.64,P =0.021)均明显缩短.而另外5个tagSNP(即rs3212986、rs735482、rs3212955、rs12610134、rs3212958)位点的基因型分布与卵巢癌患者的化疗敏感性及预后均无关(P＞0.05).结论ERCC1基因rs11615位点的SNP可能成为预测卵巢癌患者铂类药物化疗敏感性及预后的分子标志物
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原因不明复发性流产患者蜕膜组织中转录因子GATA-3及T-bet mRNA表达的研究
目的 探讨转录因子GATA-3、T-bet在原因不明复发性流产发病中的作用.方法 采用原位杂交方法,检测20例原因不明复发性流产患者(流产组)和20例正常妊娠妇女(正常妊娠组)蜕膜组织中1型辅助性T细胞(Th1)特异性转录因子T-bet和2型辅助性T细胞(Th2)特异性转录因子GATA-3的mRNA表达水平.结果 (1)GATA-3:蜕膜组织中每高倍视野平均GATA-3阳性细胞数流产组为(25±16)个,正常妊娠组为(38±16)个,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).(2)T-bet:蜕膜组织中每高倍视野平均T-bet阳性细胞数流产组为(59±17)个,正常妊娠组为(46±18)个,两组比较,差异也有统计学意义(P＜0.05).(3)两组妇女蜕膜组织中GATA-3 mRNA与T-betmRNA的表达水平呈负相关关系(r=-0.55,P＜0.01).结论 原因不明复发性流产患者蜕膜组织中T-bet表达占优势,GATA-3的表达受抑制,可能诱导了母胎界面Th1/Th2平衡向Th1偏移,从而使胚胎遭受免疫攻击而发生流产.
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缺氧诱导因子1α及其靶基因在子痫前期患者胎盘组织中的表达
目的 探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)及其靶基因血管内皮细胞生长因子(VEGF)、可溶性血管内皮细胞生长因子受体1(sFlt-1)基因在子痫前期患者胎盘组织中的表达.方法 采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法对20例重度子痫前期患者(子痫前期组)和15例正常妊娠妇女(对照组)的胎盘组织中的HIF-1α、VEGF、sFlt-1蛋白表达进行检测;同时应用RTPCR技术对两组孕妇胎盘组织中HIF-1α、VEGF、sFlt-1 mRNA水平进行检测,并进行相关性分析.结果 (1)子痫前期组HIF-1α蛋白表达(+++)者9例(45%,9/20),sFlt-1蛋白表达(+++)者11例(55%,11/20),对照组分别为2例(13%,2/15)和3例(20%,3/15),两组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);子痫前期组VEGF蛋白表达(+++)者3例(15%,3/20),明显低于对照组的7例(47%,7/15),两组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).(2)子痫前期组HIF-1α mRNA、sFlt-1 mRNA水平分别为0.604±0.013、0.898±0.041,对照组分别为0.208±0.007、0.559±0.244,两组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);子痫前期组VEGF mRNA表达水平虽高于对照组,但差异无统计学意义(P＞0.05).子痫前期组VEGF mRNA/sFlt-1 mRNA比值(0.439±0.009)低于对照组(0.824±0.011),两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).(3)子痫前期组HIF-1α mRNA的表达与sFlt-1 mRNA表达呈正相关(r=0.577,P＜0.05),与VEGF mRNA/sFlt-1 mRNA比值呈负相关(r=-0.376,P＜0.05).结论 HIF-1α在子痫前期患者胎盘组织中表达水平明显升高,主要是通过调节VEGF、sFlt-1基因的转录,而影响滋养细胞的浸润和胎盘血管重铸,参与子痫前期的发病.
关键词： 先兆子痫 胎盘 核蛋白质类 DNA结合蛋白质类 血管内皮生长因子受体1 -
重度子痫前期患者胎盘组织中缺氧适应相关基因的表达及其临床意义
目的 探讨胎盘组织中缺氧诱导因子脯氨酸羟化酶1(HPH1)和因子抑制缺氧诱导因子1(FIH-1)在重度子痫前期发病和疾病进展中的作用.方法 选择2006年7月至2007年7月在中国医科大学附属盛京医院妇产科住院选择剖宫产终止妊娠的重度子痫前期孕妇34例(重度子痫前期组)及正常晚期妊娠孕妇24例(对照组),采用RT-PCR和蛋白印迹法检测两组孕妇胎盘组织中的HPH1和FIH-1 mRNA及蛋白的表达,并与临床指标进行相关性分析.结果 (1)重度子痫前期组孕妇胎盘组织巾HPH1 mRNA及蛋白表达水平分别为0.40±0.04和59.5 ±3.4,显著低于对照组的0.84±0.12和71.6±1.7(P均<0.01);重度子痫前期组孕妇FIH-1 mRNA及蛋白表达水平分别为0.31±0.05和45.6±2.4,也显著低于对照组的0.43±0.04和54.9±2.1(P均<0.01).(2)重度子痫前期组孕妇胎盘组织中HPH1和FIH-1 mRNA及其蛋白表达水平与平均动脉压(MAP)均呈显著负相关关系,r均为-0.854(P均<0.01);与24 h尿蛋白定量均呈显著负相关关系,r均为-0.936(P均<0.01);与有无眼底动脉痉挛均呈显著负相关关系,r均为-0.854(P均<0.01).(3)两组58例孕妇胎盘组织中的HPH1 mRNA表达水平高于FIH-1 mRNA的表达,分别为0.58±0.27和0.39 ±0.10,两者呈正相关关系,,为0.686(P<0.01);HPH1蛋白表达水平高于FIH-1蛋白的表达水平,分别为64.5±6.7和49.4±5.2,两者也呈正相关关系,r为0.947(P<0.01).结论 HPHl和FIH-1的表达变化可能与蕈度子痫前期的发病及疾病进展相关.
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应用组织芯片技术研究卵巢癌组织中缺氧诱导因子1α与血管生成的关系
目的探讨缺氧诱导因子1α( hypoxia inducible factor -1α, HIF-1α)在卵巢癌组织中的表达及其与血管生成的关系.方法联合应用组织芯片和原位杂交、免疫组化技术,检测295份卵巢上皮性肿瘤(其中卵巢癌238份、交界性卵巢肿瘤19份、良性卵巢肿瘤38份)及13份正常卵巢组织中HIF-1α mRNA和血管内皮生长因子(VEGF) 的表达情况,以CD34单克隆抗体标记血管内皮细胞来检测微血管密度(MVD).结果卵巢癌、交界性卵巢肿瘤和良性卵巢肿瘤、正常卵巢组织中HIF-1α mRNA的阳性表达率分别为81.9%、42.1%、13.2%和0.交界性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中HIF-1α mRNA的表达高于正常卵巢和良性卵巢肿瘤,卵巢癌高于交界性肿瘤,差异均有统计学意义(P<0.01).卵巢癌组织中HIF-1α mRNA的表达与手术病理分期和病理类型无关(P>0.05),而与病理分级呈正相关(r=0.246,P<0.01).卵巢癌组织中HIF-1α mRNA表达与VEGF表达(r= 0.206,P=0.01)和MVD计数(r =0.451,P<0.01)均呈显著正相关.结论卵巢癌组织过度表达HIF-1α mRNA,并通过诱导VEGF促进肿瘤的新生血管形成.
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自然流产患者绒毛组织中致死基因mRNA的表达
目的探讨自然流产患者绒毛组织中致死基因维甲酸受体(RXR)α、N-myc和转录增强因子-1(TEF-1)mRNA的表达水平.方法采用逆转录聚合酶链反应技术,对38例自然流产患者的绒毛组织中RXRα、N-myc和TEF-1基因mRNA的表达水平进行检测,并和33例正常早孕妇女对比.结果 (1)RXRα和TEF-1基因mRNA表达水平,自然流产患者分别为0.4±0.3和1.6±1.1,正常早孕妇女分别为0.6±0.3和2.3±1.2,两者比较,差异有显著性(P<0.05);N-myc 基因mRNA表达水平分别为2.1±1.2和2.2±0.9,两者比较,差异无显著性(P>0.05).(2)复发性流产者(23例)与非复发性流产者(15例)的RXRα基因mRNA表达水平分别为0.3±0.2和0.6±0.4(P<0.05),TEF-1基因mRNA表达水平分别为1.0±1.1和1.9±1.2(P<0.05).结论 RXRα、TEF-1 基因可能参与调控人类胚胎的生长,其表达水平降低可能与自然流产尤其是复发性流产有关.
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血管内皮生长因子体外刺激卵巢癌细胞株信号转导及转录激活因子3磷酸化的研究
目的观察血管内皮生长因子(VEGF)刺激上皮性卵巢癌细胞株Caov-3(Caov-3细胞)后,信号转导及转录激活因子3(STAT3)磷酸化的变化,探讨磷酸化的STAT3是否参与Caov-3细胞VEGF的信号转导.方法采用免疫细胞化学和蛋白印迹的方法,测定体外不同浓度VEGF刺激Caov-3细胞STAT3磷酸化的水平;并观察能与VEGF受体2(VEGFR2)特异性结合的短肽,对VEGF刺激STAT3磷酸化的阻断作用.结果 VEGF能够刺激Caov-3细胞的STAT3磷酸化.采用免疫细胞化学和蛋白印迹方法,浓度为50 ng/ml的VEGF刺激Caov-3细胞30 min后,Caov-3细胞STAT3磷酸化水平均增高,分别为2.20±0.28和1.37±0.17,与VEGF浓度为0 ng/ml时Caov-3细胞STAT3磷酸化的水平(分别为0.56±0.15和0.47±0.19)比较,差异有极显著性(P<0.001);并且STAT3磷酸化蛋白发生向细胞核内移位.VEGF刺激Caov-3细胞60 min后,Caov-3细胞STAT3磷酸化的水平(分别为0.95±0.18和0.66±0.20),与刺激30 min时Caov-3细胞STAT3磷酸化的水平(分别为2.03±0.17和1.58±0.23)比较,差异有极显著性(P<0.001).与VEGFR2特异性结合的80 μmol/L的短肽能有效抑制VEGF诱导STAT3的磷酸化水平. 结论 VEGF在体外可诱导Caov-3细胞内STAT3发生磷酸化; STAT3的磷酸化参与了VEGF在Caov-3细胞内通过VEGFR2介导的信号转导过程.
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低氧诱导因子1α对子宫颈癌细胞生物学行为的影响
目的 探讨低氧诱导因子1α(HIF-1α)对宫颈癌细胞的生物学行为的影响以及其中可能存在的分子机制.方法 通过CoCl2化学诱导宫颈癌HeLa细胞缺氧;构建靶向HIF-1α的反义真核表达载体、经脂质体介导转染HeLa细胞的方法沉默HIF-1α的表达.将实验细胞分为常氧未转染对照(NN)组、常氧空质粒转染对照(NI)组、常氧转染pcDNA3.0/HIF-1α质粒(NT)组、缺氧未转染对照(HN)组、缺氧空质粒转染对照(HI)组、缺氧转染pcDNA3.0/HIF-1α质粒(HT)组.用四甲基偶氮唑蓝法、Transwell侵袭小室方法观察各组细胞的增殖、侵袭能力的改变,用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率,用RT-PCR技术检测各组细胞目的基因HIF-1α及其靶基因血管内皮生长因子(VEGF)、葡萄糖转运体1(GLUT1)、多药耐药基因1(MDR1)的表达变化.结果 NT组细胞在培养12、24、48、72 h时的活细胞数分别为0.053±0.003、0.074±0.004、0.148±0.015、0.192±0.038,而HT组分别为0.069±0.003、0.155±0.022、0.224±0.022、0.308±0.069;NT和HT组的细胞增殖受到抑制,NT组与NN及NI组、HT组与HN及HI组间的活细胞数分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).各组细胞的凋亡率分别是,NN组(29.27±0.18)%、NI组(31.13±0.08)%、NT组(51.11±0.14)%、HN组(11.46±0.28)%、HI组(15.77±0.49)%、HT组(40.05±0.97)%;HT组与HN及HI组、NT组与NN及NI组间分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).各组细胞的侵袭能力由高到低依次为HI、HN、NI、NN、HT、NT组,分别为(40±9)%、(37±12)%、(28±5)%、(26±7)%、(19±7)%、(10±5)%;NT组与NN及NI组、HT组与HN及HI组间分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).NT组细胞HIF-1α、VEGF、GLUT1、MDR1 mRNA的相对表达量分别为0.05±0.12、0.09±0.11、0.08±0.15、0.05±0.15,而HT组分别为0.04±0.16、0.16±0.16、0.12±0.20、0.20±0.21;NT组与NN及NI组、HT组与HN及HI组间分别比较,HIF-1α、VEGF、GLUT1、MDR1 mRNA的相对表达量均有降低,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 HIF-1α可能主要通过其下游的靶基因对宫颈癌细胞的恶性生物学行为产生影响,包括抗凋亡、促增殖、增加血液供应和能量供应、耐药等,且体外抑制HIF-1 α的表达对宫颈癌细胞有抑制作用.
