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Mdx鼠的肌电图和重频电刺激的研究
目的:研究成年和老年肌营养不良症模型鼠(mdx鼠)骨骼肌的肌电图、运动传导潜伏期以及重频电刺激的特点.方法:分别对成年和老年mdx鼠、对照成年和老年C57鼠的腓肠肌、胫前肌、小趾肌进行肌电图检测,并用钝针叩击记录电极附近局部的肌腹,观察有无强直性电位发放.让受试鼠休息数分钟后,进行对侧坐骨神经运动传导潜伏期的检测和重频电刺激检测.结果:插入电极时,见mdx鼠的插入电活动延长,在受检肌轻收缩状态下,mdx鼠骨骼肌的运动单元电位的平均时限、平均波幅明显低于同龄对照C57鼠(p＜0.05),多相电位也明显增多(＞20%).而运动传导潜伏期无显著性差异(P＞0.05),在叩击局部肌组织时,mdx鼠和C57鼠均未见肌强直电位发放.在对mdx鼠的C57鼠重频电刺激时,无论高频或低频电刺激,均未见波幅的改变.结论:mdx鼠骨骼肌肌电图改变既不支持神经性损害、神经肌肉接头损害,也不支持肌强直性改变,而是和肌营养不良症一样,具有典型的原发性肌病的改变.
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超声生物显微镜结合组织多普勒成像评价心肌病小鼠心功能
目的 本实验以低月龄的mdx转基因小鼠为早期心肌病模型,应用超声生物显微镜(UBM)结合组织多普勒技术(TDI)对mdx小鼠及对照组进行心功能评价,探讨UBM在早期诊断小鼠心肌病变中的应用价值.方法 对同龄的mdx心肌病小鼠和同系对照C57BL/6小鼠进行UBM检查(每组20只),对比分析EF、FS以及非标准切面测量左室游离壁基底段的TDI(IVC、Sa、Ea、Aa)等心功能指标,并对两组小鼠进行病理组织学检查.结果 采用UBM进行TDI成像的40只小鼠中有38只获得成功,2只小鼠(mdx鼠、对照鼠各1只)图像质量不佳未予采用.比较对照组,mdx组的IVC、Sa减低(P＜0.05),EF、FS差异无显著性意义(P＞0.05)；病理组织学检查证实mdx低月龄小鼠存在心肌病变.结论 UBM结合TDI技术可量化评价心肌病小鼠模型局部心功能及病变程度,较常规心功能指标敏感,可用于心肌病变的早期诊断.
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Mdx小鼠骨骼肌纤维化及Spp1基因表达
目的：通过观察Duchenne型肌营养不良的模型鼠mdx小鼠骨骼肌中纤维化情况，研究Spp1基因在mdx小鼠及其对照鼠中不同时期的表达，探讨在mdx小鼠中Spp1与肌纤维化的关系。方法选取雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju鼠为实验组，雄性C57BL/6ScSn小鼠为对照组，根据年龄分为2w组、4w组、8w组、12w组。每组选取6只，3只用于冰冻切片的苏木精-伊红染色及马松（masson）染色，3只用于基因芯片及qRT-PCR。结果2w及4w时mdx小鼠无明显结缔组织增生，8w时，mdx小鼠可见轻度结缔组织增生；12w时，mdx小鼠结缔组织增生程度较8w稍加重，仍为小片状区域的纤维化,对照组小鼠不同时期均未见纤维化；mdx小鼠2w与12w股四头肌基因芯片表达谱对比，其中Spp1基因在mdx小鼠2w与12w相比fold-change值为-15.1354，变化明显； Spp1在mdx小鼠股四头肌不同时期表达量比较：8w组较4w组明显升高，12w组较8w组表达量下降，但仍高于4w组，8w组与12w组Spp1表达量较同期对照组明显升高，差异具有统计学意义。结论 mdx小鼠早期（2w~4w）肌纤维化表现不明显，8w时骨骼肌内可见少量结缔组织增生，随后缓慢进展。②Spp1基因在mdx小鼠成熟期（8w~12w）表达量明显增加，推测其在mdx小鼠肌纤维化中发挥一定作用。
关键词： Duchenne型肌营养不良 骨骼肌纤维化 SPP1基因 mdx小鼠 基因芯片 -
mdx小鼠骨骼肌组织成肌、成脂、成骨基因的特异性表达
背景:干细胞移植是治疗肌营养不良症的有效方法之一,但移植的干细胞在病理骨骼肌中成肌表达较低.目的:通过比较mdx 小鼠和C57 小鼠的骨骼肌形态及成肌、成脂、成骨基因表达的差异,探讨mdx 小鼠骨骼肌病理改变的可能机制.方法:取mdx 小鼠与C57 小鼠的骨骼肌组织行冰冻切片,苏木精-伊红染色和Vonkossa染色观察两种小鼠肌肉组织的形态特征;提取mdx 小鼠和C57 小鼠骨骼肌组织总RNA,real-time PCR 检测成肌、成脂、成骨相关基因的表达.结果与结论:mdx 小鼠骨骼肌有肌纤维坏死和再生,伴有轻度脂肪、纤维结缔组织增生,Vonkossa 染色可见钙结节沉积,而C57 小鼠的骨骼肌细胞形态清晰,核位于细胞周边.与C57 小鼠比较,mdx 小鼠肌肉组织成骨、成脂基因表达有不同程度的上调(P < 0.05),而成肌基因表达下调(P < 0.05).dystrophin 基因缺失及成肌基因表达下调、成骨和成脂基因上调是造成mdx 小鼠肌肉组织变性坏死的原因.
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Mdx小鼠骨骼肌中炎症反应和mpeg1的表达
目的 探讨mdx小鼠不同时期骨骼肌的炎性病理改变,观察mpeg1在mdx小鼠及对照鼠中的表达.方法 选取雄性C57 BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju鼠为实验组,对照组为雄性C57 BL/6ScSn小鼠,根据年龄分为2w、4w、8 w、12w4个亚组.通过HE染色、MGT染色、ACP染色观察骨骼肌光镜下的形态学改变,总结mdx小鼠骨骼肌炎性病理变化.通过RNA提取,基因芯片的检测及mpegl的qRT-PCR检测,观察mpeg1的表达情况.结果 常规组织染色中,2w的mdx小鼠肌肉偶见高度浓染的肌纤维,未见肌细胞坏死,炎症细胞浸润,4w可见巨噬细胞吞噬现象散在分布,8 w时炎细胞浸润灶融合成片,12w时炎性病灶面积减小;利用基因芯片技术筛选出mdx小鼠中有关炎症反应的基因30余个,结果显示与2 w相比,炎症反应相关基因表达量均增加,在8 w时达到峰值,12 w有所下降,但较2 w时仍有升高;qRT-PCR结果显示从4w开始,mdx小鼠中mpeg1的含量逐渐增加,8 w时含量高.结论 (1)炎症反应参与mdx小鼠疾病的发生发展:从2w开始出现,8 w达到高峰,12 w趋于平稳;(2)Mpeg1在mdx小鼠炎症反应中发挥了一定的作用.
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补肾方辅助骨髓干细胞移植治疗DMD的实验研究
目的:观察补肾方辅助骨髓干细胞移植治疗mdx小鼠的效果.方法:体外培养正常C57BL/6小鼠骨髓细胞对放疗后mdx小鼠尾静脉移植,用补肾方水提液灌胃实验鼠,观察实验小鼠存活率和移植物抗宿主病(GVHD)症状;移植后4个月/8个月取小鼠骨骼肌以HE染色观察病理状况,以免疫荧光方法检测细胞骨架蛋白(DYS蛋白)表达.结果:补肾方能不同程度降低mdx鼠核中心移位比例和提高DYS蛋白表达量;同时能明显减轻GVHD症状.结论:补肾方能提高骨髓干细胞移植治疗mdx小鼠的效果.
关键词： 补肾方 骨髓干细胞移植 Duchenne型肌营养不良症 mdx小鼠 -
糖皮质激素治疗Duchenne型肌营养不良机制的实验研究
目的:对应用糖皮质激素(glucocorticoid,GC)治疗Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)的机制进行探讨.方法:应用DMD动物模型mdx小鼠进行实验,将模型组随机分为3组,Mdx模型组(6周龄)、Mdx安慰剂组(12周龄)、Mdx GC治疗组(12周龄),每组8只,另取正常C57小鼠,6周龄和12周龄各8只,作为正常对照组,分别进行悬吊实验,测量时间,观察治疗前后时间变化;测量血清CK值,了解肌肉损伤情况;对所分离的腓肠肌进行HE染色,在电镜下观察病理变化;检测肌肉中Utrophin蛋白表达状况,应用Western blot进行检测,同时获得核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、I-κB、热休克蛋白70(heat shak protein,HSP70)蛋白表达水平,采用独立样本t检验、方差分析(多重比较)和配对t检验统计方法发现与前者关系所在.结果:GC治疗实验动物出现明显变化,与安慰剂相比具有差异明显:①Mdx小鼠与治疗前相比肌力明显好转;治疗前悬吊实验时间为(22±11)s,治疗后为(43.8±24.9)s,P＜0.001,CK值下降明显,治疗前为(20 230±2 444) U/L,治疗后为(6 457±2 215) U/L,P＜0.001;②Mdx小鼠腓肠肌电镜下进行细胞学观察,发现较前明显好转;③Mdx小鼠肌肉组织中HSP70蛋白表达水平明显增加,OD比值由治疗前0.50±0.09上升至治疗后0.75±0.09,P＜0.001,而Utrophin蛋白表达从0.23±0.03上升至0.42±0.08,P=0.003,NF-κB蛋白表达由治疗前0.33±0.04下降至0.26±0.02,P＜0.001,治疗前后I-κB蛋白表达由0.21±0.06变至0.18±0.05,P=0.372.结论:应用GC治疗后HSP70表达增强,NF-κB活性下降,Utrophin表达增加,从而使Mdx小鼠的肌肉病变有所延缓,肌力增加.
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成肌细胞移植治疗假肥大型肌营养不良症的实验研究
目的 研究成肌细胞移植治疗假肥大型肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy,DMD)的效果,探讨基因治疗DMD的方法及可行性. 方法 用多步酶消化法与差速贴壁法培养C57/BL10小鼠成肌细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态.取第4代细胞用5-BrdU标记.将24只DMD模型鼠--mdx小鼠(4～6周龄,雄性,体重13.8～24.6 g)随机分为两组(n=12),A组经尾静脉分2次(间隔2周)注射1×106个/mL标记后成肌细胞,B组同法注射1 mL DMEM/F12培养基为对照.术后4周采用一次性游泳力竭实验检测小鼠运动能力,处死后取材行HE染色及5-BrdU、结蛋白、抗肌萎缩蛋白(dystrophin,Dys)免疫组织化学染色观察,并行图像分析. 结果 原代成肌细胞培养5～7 d后即可传代,可获得稳定传代及足量的细胞.A组小鼠一次性游泳力竭时间为(60.72±5.76)min,B组为(47.77±5.40)min,两组比较差异有统计学意义(P<0.01).术后4周HE染色示A组可见变成圆形且透明染色的肌细胞,肌纤维细胞核中心移位(centrally nucleated fibers,CNF)比例为67%;B组肌纤维粗细不等,可见肥大、萎缩、变性和肌纤维坏死等改变,CNF比例>80%.免疫组织化学染色示,A组5-BrdU、结蛋白、Dys表达均呈阳性,B组少见表达或呈阴性表达.图像分析结果显示,A、B组结蛋白积分吸光度(IA)值分别为489.70±451.83和71.15±61.14,阳性面积占视野总面积的比值分别为0.314 3±0.197 3和0.102 8±0.062 8(P<0.05);Dys IA值分别为5 424.64±2 658.01和902.12±593.51(P>0.05),阳性面积占视野总面积的比值分别为0.323 7±0.117 7和0.035±0.032 9(P<0.05). 结论 成肌细胞移植治疗小鼠DMD有一定的治疗作用.
关键词： 成肌细胞 假肥大型肌营养不良症 基因治疗 5-BrdU标记 mdx小鼠 -
骨髓胚胎样干细胞体内重建dystrophin的表达
目的 观察骨髓胚胎样干细胞体内再生dystrophin的可行性.方法 采用SSP-PCR方法鉴定mdx小鼠的基因型.分离扩增入骨髓胚胎样干细胞,采用DIR标记后,注射细胞到mdx小鼠腹股沟三角皮下,采用活体成像法观察植入细胞的存活情况,采用免疫荧光染色法检测dystrophin的表达.结果 杂合子鼠交配可以产生3个基因型的子代鼠,采用SSP-PCR可以鉴定出mdx小鼠基因型;采用无血清培养基可从骨髓中分离到表达SSEA-4和FZD-9的胚胎样干细胞,可在注射细胞的mdx小鼠离体后肢肌肉检测到明显的荧光信号,并在肌肉组织中检测到人dystrophin的表达.结论 人骨髓胚胎样干细胞可在mdx小鼠体内存活并表达dystrophin.
关键词： 骨髓 胚胎样干细胞 mdx小鼠 基因型 dystrophin Duchenne型肌营养不良 -
MSC介导CD30L等4种炎症相关因子在治疗DMD中发挥作用
目的 研究mUCMSC移植治疗DMD标准模型mdx小鼠后炎症相关因子变化,探讨MSC治疗DMD相关机制.方法 PCR鉴定出mdx小鼠随机分为两组:生理盐水组和治疗组;另取正常C57小鼠作为正常对照组.治疗组腹腔注射mUCMSC的生理盐水细胞悬液,生理盐水组和对照组输入等体积生理盐水,检测血清CK值;对各组小鼠的腓肠肌进行HE染色,显微镜下观察病理变化并计数CNF;采集mdx小鼠腓肠肌组织用QAM-INF-1蛋白芯片测定小鼠肌组织炎症因子含量.结果 治疗组与生理盐水组相比具有差异明显:(1)Mdx小鼠血清CK值生理盐水组为(1374.60±127.13) U/L,治疗组为(434.60±19.39) U/L,显著低于生理盐水组(P＜0.05);(2)治疗组mdx小鼠腓肠肌切片显示细胞间炎性细胞浸润减轻,细胞大小趋于统一,核中心移位现象减少;(3)生理盐水组mdx小鼠腓肠肌细胞CNF可达(94.37±11.65)％,治疗组CNF为(80.37±7.65)％,显著减少(P＜0.05);(4) mdx小鼠后肢腓肠肌组织中CD30L、IL-21、MIP-1a、PF4含量明显较低(P＜0.05).结论 mUCMSC治疗后,腓肠肌组织中CD30L IL-21、MIP-1a、PF4含量较低,血清CK值降低,细胞损伤减少.肌组织炎症表现减轻,在mUCMSC治疗DMD中发挥作用.
关键词： Duchenne型肌营养不良 蛋白芯片 脐带间充质干细胞 mdx小鼠
