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二代测序技术在Alport综合症应用中的新进展
Alport综合征(Alport syndrome,AS)是一种遗传性肾病,是由编码α3、α4、α5(IV)胶原三聚体的COL4A3,COL4A4或COL4A5基因突变引起的.AS目前仍缺乏有效的治疗措施,故对AS早期确诊、治疗、延缓进展以及提供AS家系遗传学分析,减少遗传风险意义重大.随着二代测序技术的成熟与广泛应用,为尚未发现热点突变的AS患者基因测序及诊断提供了新方法.同时针对罕见病,建立生物样本库也是未来罕见病研究发展趋势.本文将重点介绍二代测序技术近年来在AS应用及诊断中的进展情况.
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二代测序技术检测不同环境下美洲大蠊 携带细菌的研究
目的 研究二代测序技术(NGS)在美洲大蠊携带细菌检测中的应用,建立一种可检测美洲大蠊体内、体表所携带未知种类细菌的方法,分析不同环境下美洲大蠊携带细菌情况及其与环境的关系.方法 2016年8-9月,以中山地区居民区、港口和医院环境中捕获的美洲大蠊为材料,对其16S rDNA V1~V9可变区分析,选取V3~V4可变区作为目的基因,利用NGS对其携带的细菌种类进行检测和分析.结果 港口、居民区和医院采集的美洲大蠊分别携带1564、1786和1779个运算分类单位;利用NGS分别可鉴定出细菌123属36种、131属42种和136属48种,细菌种类数超过传统方法.通过对样品进行物种多样性和聚类分析发现,同一环境下的样本无法完全聚集在一起.结论 16S rDNA V3~V4可变区适合对美洲大蠊体内、体表携带的细菌进行检测,利用NGS可一次性检出多种细菌;其检出的细菌种类远超出传统方法且操作简便;美洲大蠊携带细菌的种类与其生存环境无明显的区域特异性.
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利用目标基因捕获结合二代测序技术发现左心室心肌致密化不全MYBPC3基因错义突变
目的:建立目标基因捕获结合第二代测序技术,对孤立性左心室心肌致密化不全(IVNC)患者的已知致病基因MYBPC3进行突变筛查.方法:收集5例IVNC患者及一级亲属的超声影像学资料,并提取外周血全基因组DNA,设计MYBPC3外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,富集目标基因组区域DNA片段,利用二代测序技术,确定突变位点,并使用Sanger测序法在其一代亲属中验证.结果:目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA目标靶片段.在5例IVNC患者中,发现1例MYBPC3基因杂合非同义突变c.G1000A(p.E334K),该突变位于MYBPC3基因第13外显子中,测序深度249.65.经过数据分析与Sanger测序验证后,父亲发现此突变位点,母亲未发现提示突变的父亲的遗传.结论:本研究所建立的GenCap目标基因捕获测序技术结合二代测序技术成功发现了MYBPC3基因突变.
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二代测序技术在白化病家系检测中的应用及突变分析
目的 采用二代测序技术对一白化病家系进行相关基因突变的检测,了解携带者的突变类型,并依据检测结果提供相应的遗传咨询指导意见.方法 采集先证者及其家系成员外周血并提取基因组DNA,对先证者进行白化病18个相关基因编码外显子序列分析,结合生物信息学分析基因突变位点,然后利用Sanger测序对可疑致病位点进行验证.结果 18个相关基因编码外显子序列分析结果显示,先证者存在OCA2基因c.406C>T(R136*)杂合复合OCA2基因c.1922C>T(S641L)杂合突变,父母双方表型正常,父亲基因型为OCA2基因c.406C>T(R136*)杂合突变,母亲基因型为OCA2基因c.1922C>T(S641L)杂合突变,经生物信息学分析认为上述突变位点为致病性突变的可能性大.结论借助于二代测序技术可以更加快速地检测基因突变位点,为临床指导白化病家庭进行优生优育、预防二胎白化病再发提供科学指导.
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二代测序技术指导NSCLC进展后后续治疗的临床观察
1 病例报告病例1:患者男,37岁,2015-04-19因“胸闷4d,加重伴呼吸困难1d”就诊于吉林省前卫医院门诊,肺CT检查示左侧大量胸腔积液.为求进一步诊治于2015-04-20就诊于吉林大学第一医院,门诊以“胸腔积液待查”收入院.既往史:体健,否认吸烟史.查体:左侧第6肋间以下叩诊浊音,触诊语音震颤减弱,听诊呼吸音消失,双肺未闻及干湿罗音.肺部CT检查示,左侧上叶病灶大小约2.5 cm×3.4 cm,左肺大量胸腔积液,引流液为血性;颅脑CT检查提示脑转移,骨扫描检查提示左第2肋骨放射性增高伴骨质破坏,考虑伴有骨转移,其余部位无转移(图1).3次胸水脱落细胞学检查均找到腺癌细胞,胸水检测结果显示,EGFR基因第21外显子点突变(L858R).根据国际肺癌研究协会2009年第七版分期标准,诊断为左肺上叶腺癌T2aN0M1(Ⅳ)期,EGFR突变:21-L858R.
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二代测序技术在微生物和感染性疾病中的应用
随着感染性疾病防治在卫生保健方面的重要性日益凸显,感染性疾病引起的社会关注逐渐增多,新技术在人类预防和控制病原体传播方面发挥着巨大作用.微生物实验室作为病原体检测的一线科室,通过镜检、 培养、 鉴定、药敏等方法,在感染控制中发挥着重要作用.传统分子诊断和基因分型方法提供的信息有限,通常不能满足疫情暴发和传播调查需求.二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)在单次序列测定中可确定菌株基因组完整的DNA序列,并从这些数据中得到抗菌药物耐药性、 毒力及分型等可用于疫情调查的信息,进一步用于开展疫情特异性筛查.本文概述NGS技术及其在医院感染性疾病暴发调查、 未知病原体鉴定、 毒力分析、 耐药基因组研究等临床微生物领域中的应用.
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高脂血症长爪沙鼠模型的转录组检测和代谢性炎症通路的初步研究
目的：研究饮食诱发的高脂血症长爪沙鼠模型的关键基因及代谢性炎症通路调控网络。方法利用RNA-Seq测序技术及生物信息学技术对正常组与模型组两个RNA池进行测序和分析。结果 De novo拼接后获得有效长爪沙鼠基因47522个（即≥100 bp的unigene），大小26.9 Mb，与GenBank中现有的基因比对结果表明，约82.53％的序列与基因组上的外显子序列同源；诱发高脂血症动物与正常动物之间共获得21125个差异基因，其中16087个下调，5038个上调，模型组相对于正常组存在显著的下调关系（ P＜0.01）。其中与长爪沙鼠高脂血症代谢性炎症密切相关的通路有8个（P＜0.01），这8个通路所表达的基因中有15个与免疫和炎症相关的基因显著下调（ P＜0.01）。结论 RNA-Seq测序和生物信息技术可作为研究高脂血症动物模型的整体基因转录的工具，筛选出的关键基因和通路可作为研究的候选基因或操作靶点。
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成人急性B淋巴细胞白血病患者基因突变谱及预后意义
目的 探讨成人急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患者的基因突变谱,并分析其对患者预后的影响.方法 收集113例2009年6月至2015年9月收治的成人B-ALL患者DNA标本,采用靶向特异的二代测序技术,针对血液恶性疾病相关的112种基因进行突变分析,通过多个数据库筛选出可能致病的基因突变,描述其发生频谱,并通过Kaplan-Meier、Cox回归模型分析突变基因对患者总生存(OS)和无复发生存(RFS)的影响.结果 113例患者中103例(92.0％)发生至少一种基因突变,29例(25.6％)患者发生≥3种基因突变.所有患者中突变率较高的基因有SF1、FAT1、MPL、PTPN11、NRAS等,Ph阳性B-ALL和Ph阴性B-ALL患者中基因突变特点不尽一致.进一步分析基因突变对患者预后的影响,发现在Ph阴性B-ALL中伴JAK-STAT信号通路相关基因突变的患者(如JAK1、JAK2突变)较该信号通路未受影响的患者预后差(OS:P值分别为0.011和0.001;RFS:P值分别为0.014和＜0.001),而伴PTPN 11突变的B-ALL患者较不伴PTPN 11突变的患者有较好的OS及RFS,但差异无统计学意义(P值均＞ 0.05);在Ph阳性B-ALL患者中,表观遗传学修饰相关的信号通路异常的患者预后较差(OS:P=0.038;RFS:P=0.047).结论 基因突变在成人B-ALL中存在普遍性,发生频谱因亚型而异,涉及多种信号通路,JAK家族相关基因突变常提示患者预后较差,突变基因之间的共存现象也预示着成人B-ALL患者的遗传复杂性和不稳定性.
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二代测序技术在实体肿瘤诊疗中的应用及研究进展
随着分子生物学的飞速发展,分子诊断技术已经广泛应用于遗传性疾病诊断、感染性病原体筛查、肿瘤突变基因检测,伴随诊断和预后评估等领域,特别是在肿瘤的诊断和治疗中逐渐起到越来越重要的作用.目前应用于临床肿瘤分子诊断的技术主要包含了流式细胞术(flowcytometry,FCM)[1]、荧光原位杂交(fluorescencein-situhybridization,FISH)[2]、聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)[3-4]、微阵列芯片[5]和基因测序技术[6-8].FCM主要通过单个细胞或生物微颗粒的定量分析考察其生物学性质以检测肿瘤或是癌前病变的发生,FISH、PCR和微阵列芯片技术,主要是通过一定的方式抓取已知的片段序列以确定目标的有或无,这几种技术的重点在于"检",而基因测序技术是采取特定的手段将还有遗传信息的核酸一个一个测出来,其重点在于"测",目前应用范围大的就是二代测序(next-generationsequencing,NGS).现就NGS在实体肿瘤诊疗中的应用及研究进展综述如下.
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二代测序技术检测房颤伴高度房室传导阻滞患者致病基因分析
目的 利用高通量二代测序技术检测房颤伴高度房室传导阻滞致病基因.方法 收集1个房颤伴高度房室传导阻滞家系的临床资料,同时采集外周血进行高通量测序筛查致病基因,发现可疑致病基因后采用多种生物信息学软件预测该突变的致病性.结果 发现先证者及其1个女儿均携带心脏缓慢延迟整流钾通道编码基因KCNQ1 c.407G＞ T(p.C136F)突变,而家系内其余成员均无该突变.c.407G＞ T(p.C136F)突变位于KCNQ1通道的S1段,生物信息学软件预测该突变位点是有害突变,可能通过影响通道蛋白功能而致病.结论 采用二代测序技术发现房颤伴高度房室传导阻滞患者携带KC-NQ1 c.407G ＞T(p.C136F)突变,该突变可能通过影响通道蛋白功能而致病.
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植入前胚胎遗传学诊断及筛查技术与规范
近年来,随着分子生物学和辅助生殖技术的进步,植入前胚胎遗传学诊断(PGD)和植入前胚胎遗传学筛查(PGS)技术以前所未有的速度在全球快速发展.文章从适应证、取材、遗传诊断技术以及伦理学等多方面对PGD和PGS进行阐述.
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二代测序技术在诊断神经系统感染性疾病中的应用
神经系统感染性疾病(以下简称神经感染性疾病)是一种常见的神经系统急危重症,如果不能及早地识别其致病病原体,并给予针对性的抗病原治疗,患者的病情往往将快速进展、发生昏迷甚至死亡.因此,对于神经感染性疾病的病原确定往往十分关键[1].经典的病原学检测方法主要包括细菌(真菌)培养、镜检和抗体检查,以及基于PCR的病原特异核酸检测,这些方法在神经感染性疾病诊断中取得了很大的进展,但在总体上其诊断灵敏度仍较低,时效性差,病原体鉴定信息和耐药信息不全面,且对于未知或少见、罕见的病原微生物,无法进行识别.因此,临床诊断神经感染性疾病的难度很大[2].
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CHD8基因新发突变的孤独症谱系障碍1例报道并文献复习
目的 提高对孤独症谱系障碍(ASD)CHD8基因突变患几临床表型和基因型的认识.方法 回顾性分析1例存在CHD8基因突变的ASD患儿的临床资料,并文献复习.结果 ①男,3岁3月龄,头围55.0cm(＞4s),身高107.0 cm(＞2 s),体重23.5 kg(＞2 s).有典型的ASD表现,运动明显落后,有慢性便秘史.②提取患儿及其父母静脉血DNA,以二代高通量测序技术对4 813个临床相关基因的外显子区进行测序,共检测到变异8 982个,经筛选流程筛选ASD相关的EHMT1、PCDH9、NLGN4X的错义突变,CHD8的无义突变(c.307C＞T,p.Gln103*)有致病可能.Sanger测序显示患儿EHMT1、PCDH9的突变来源于父亲,NLGN4X的突变来源于母亲,患儿父母未发现CHD8的突变.③目前国外共报道了CHD8基因与神经发育障碍有关的15个重要突变;CHD8基因突变患者的临床表型包括ASD表现(87％)、身材高大(86％)、大头畸形(80％)、慢性便秘或间歇性腹泻(80％)、运动落后(67％)和睡眠异常(67％)等,本文病例临床表型与文献报道较为一致.结论 CHD8基因是ASD重要的易感基因;ASD患儿合并大头畸形、生长过快,且有慢性便秘或间歇性腹泻时应考虑CHD8基因突变可能,可行基因检测协助诊断.
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胚胎植入前遗传学诊断新技术的研究进展
胚胎植入前遗传学诊断(PGD)是配合辅助生殖技术而发展起来的一类诊断技术,其通过检测体外培养的包括染色体拷贝数变异情况、易位倒位情况、单基因突变情况等排除遗传异常胚胎,将正常的胚胎植入母体继续发育,提高植入成功率,降低流产率,避免异常染色体遗传人子代.随着芯片杂交技术、二代测序技术和显微延时摄像技术等的出现,植入前遗传学诊断不断向高分辨率、高特异性、无创的方向发展.文章主要就该领域近年来涌现的新技术,特别是MicroSeq-PGD技术、等位基因映射识别技术(MaReCs)、基于cfDNA的胚胎植入前诊断技术等新的研究进展进行综述.
关键词： 胚胎植入前遗传学诊断 杂交技术 二代测序技术 显微延时摄像技术 细胞游离DNA -
二代测序技术监测急性淋巴白血病的克隆演变
目的 采用二代测序技术监测复发儿童B细胞急性淋巴白血病(B cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)的克隆演变.方法 20例B-ALL患儿的初诊和复发骨髓标本,分别提取全基因组DNA,通过多重PCR方法扩增免疫球蛋白重链基因(immunoglobulin heavy chain,IGH)互补决定区3(complementarity determining region 3,CDR3)序列并进行二代测序检测.结果 20例B-ALL患儿初诊骨髓标本IGH CDR3测序结果显示,17例有CDR3特异性序列,其中9例有1种CDR3特异性序列,7例有2种CDR3特异性序列,1例有3种CDR3特异性序列;复发骨髓标本IGH CDR3测序结果显示,16例有CDR3特异性序列,其中9例有1种CDR3特异性序列,7例有2种CDR3特异性序列;对初诊和复发标本CDR3序列进行比对分析,发现4例患儿出现克隆演变.结论 采用二代测序技术可监测儿童B-ALL复发过程中的克隆演变.
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二代测序技术在杜氏肌营养不良症家系中的分子诊断应用
对22例临床拟诊断为杜氏肌营养不良症(DMD)患儿的家系临床资料进行分析,探讨二代测序(NGS)技术在DMD患者分子诊断中的临床应用价值.先证者同时送检遗传性神经肌肉病相关panel行NGS检测和Dystrophin基因多重连接探针扩增术(MLPA)检测,分析两种方法检出的Dystrophin基因外显子缺失/重复突变结果,Dystrophin基因点突变经Sanger测序验证.通过NGS测序,22例先证者均检出Dystrophin基因突变,其中外显子缺失/重复型突变14例,点突变及微小变异8例.MLPA检测结果与NGS检测结果一致.Sanger测序结果显示NGS检测出的点突变及微小变异是正确的.1例错义突变c.6290G＞T,1例无义突变c.3487C＞T,4例微小缺失导致的移码突变c.1208delG、c.7497_7506delGGTGGGTGAC、c.9421_9422delAA、c.8910_8913delTCTC在人类基因突变数据库中均未见报道,为Dystrophin基因新突变.该研究结果显示NGS技术可全面检测Dystrophin基因外显子缺失/重复、点突变、微小缺失和内含子突变等变异,在DMD患者分子诊断中的临床应用有一定价值,值得推广.
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二代测序技术检测转移性结直肠癌患者循环肿瘤DNA中RAS/BRAF突变状态的研究
目的 探讨采用二代测序技术(NGS)检测转移性结直肠癌患者循环肿瘤DNA中RAS/BRAF突变状态代替组织检测的可行性,并分析影响血液与组织基因检测结果一致性的因素.方法 选取2015年11月份至2016年7月份我院收治的108例转移性结直肠癌患者,运用NGS检测循环肿瘤DNA中RAS、RAF的突变状态,与标准组织检测方法结果进行比较.结果 血液、组织KRAS检测结果一致的为62例,不一致33例,整体一致性65.26%.BRAF突变检测结果一致共89例,不一致6例,整体一致性93.68%,NRAS基因检测结果92例一致,不一致3例,一致性为96.84%.结论 采用二代测序技术检测转移性结直肠癌患者循环肿瘤DNA中RAS/BRAF突变状态代替组织检测具有有效性和可行性,化疗、靶向治疗、肿瘤异质性等因素是影响血液与组织检测结果是否一致的主要因素.
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运用二代测序技术产前诊断ZMPSTE24基因突变
[目的]探讨二代测序技术结合Sanger测序验证法在一原发性部分性绒毛膜羊膜病理性分离家系致病基因检测的作用,探索临床罕见胎儿疾病的产前诊断思路与方法.[方法]采用全基因外显子高通量测序方法,在ZMPSTE24基因中发现两个致病突变,随后对先证者及其父母的致病位点进行Sanger测序验证,明确致病位点后,对第3次妊娠胎儿行绒毛取样术实施产前诊断,分析致病位点.[结果]检测到先证者在ZMPSTE24基因第10个外显子上发生了框移突变(c.1389至c.1390缺失AG,来源于母亲)以及在ZMPSTE24基因第8个外显子上发生了错义突变(c.1006G＞C双重杂合改变,来源于父亲).再次妊娠产前诊断结果提示胎儿为基因突变(c.1006G＞C)携带者,突变来源于父亲.[结论]本研究运用全外显子测序技术成功分离出ZMPSTE24基因的两个新突变,对一曾出现相同两次原发性部分性绒毛膜羊膜病理性分离的孕妇再次妊娠行早期绒毛取样术产前诊断.该ZMPSTE24基因突变与mandibuloacral dysplasia with type B相关.新突变可能是该原发性部分性绒毛膜羊膜病理性分离病例的病因.为临床上罕见疾病的病因检测及胎儿宫内诊断提供参考方法与思路.
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胚胎植入前遗传学筛查技术在高龄妇女助孕中的应用
高龄妇女(≥35岁)的生育力下降,卵母细胞和胚胎的非整倍体发生率高,流产风险大,出生缺陷发生率高,一直是生殖领域的难题。胚胎植入前遗传学筛查技术( preimplantation genetic screening,PGS)是指在体外受精及胚胎培养过程中,对卵母细胞的第一、第二极体及早期胚胎行染色体结构和数目的检测,选择染色体整倍体的胚胎移植入宫腔,以期改善体外受精-胚胎移植的临床结局。随着辅助生殖技术及现代分子遗传学的发展,新的活检方法及遗传学分析技术不断出现,如囊胚期滋养外胚层细胞活检、微阵列技术、二代测序技术等,使得胚胎植入前PGS的诊断效率和精确度不断提高。本文就胚胎植入前PGS在高龄妇女助孕中的应用及进展进行综述,探讨其在改善高龄妇女妊娠结局中的临床价值。
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一例6q部分三体1q部分单体患儿的分子细胞遗传学分析
目的 确定1例多发畸形患儿的核型,探讨二代测序技术在其分子遗传学诊断中的应用.方法 应用G显带对患儿及其父母进行核型分析,进一步采用二代测序技术对三者进行测序分析,确定其异常染色体片段的大小及来源,并用Mate-pair及PCR确定其是否来源于父母.结果 G显带染色体分析显示患儿核型为46,XX,add(1)(q44)dn,其父母核型正常;二代测序结果显示患儿存在6q24.3-q27三体,并将断裂位点定位于6q24.3,此外还发现患儿1号染色体存在一约2.5 Mb的微缺失,其父母二代测序结果正常;Mate-pair及PCR分析提示上述部分三体为新发畸变.结论 患儿的异常表型可能与6q部分三体有关.与传统的细胞遗传学分析方法相比,二代测序具有高分辨率和高精确性的优点.
