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浅谈全自动生化分析仪的校准体会
全自动生化分析仪测定结果的可靠是由其精密度、准确性及可比性所决定的,生化分析仪测试出来的标本结果是随着标准的设备不同而变化的.在卫生部临床检验中心拟定的"临床实验室室内质控工作指南"中明确提出"对测定标本的仪器一定要求进行校准,校准要选择合适的校准品;如果可能,校准品应能溯源到参考方法和参考物质;对不同的分析项目要根据其特性确立各自的校准频率."这说明校准仪器是室内质控的重要部分,强调了校准工作的必要性和重要性.本文结合对奥林巴斯AU400的调试经验就仪器校准间题浅谈一些体会.
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建设临床生化参考测量系统
参考测量系统由参考测量程序、参考物质和参考测量实验室组成,是临床检验量值溯源的源头.目前临床生化参考测量系统不健全正在阻碍国产试剂的发展,因此应大力建设参考测量系统,包括研制参考物质和建设参考测量实验室.
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一种高效制备人β2微球蛋白标准物质的方法和应用
目的 构建重组人 β2微球蛋白表达体系,高效快速获取 β2微球蛋白,为临床实验室检测参考物质的制备奠定基础.方法 优化人 β2微球蛋白序列,人工合成优化序列片段并与麦芽糖结合蛋白(MBP)分别克隆至pRSF-Duet载体以构建重组人 β2微球蛋白表达质粒.使用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)对重组质粒进行诱导表达,TEV蛋白酶切除MBP,全自动生化仪测定 β2微球蛋白浓度.对重组蛋白在4℃和 –20℃储存条件下的稳定性进行检测,对 β2微球蛋白纯品与校准品的互通性进行分析.结果 成功构建重组人 β2微球蛋白表达质粒,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)成功诱导重组蛋白表达,MBP-β2微球蛋白(MBP-β2-MG)浓度可达100 mg/L,β2微球蛋白浓度可达185 mg/L.在4℃和 –20℃储存条件下监测64周,β2微球蛋白稳定存在.β2微球蛋白纯品与RANDOX生化校准品互通性良好.结论 通过密码子优化,成功构建了重组 β2微球蛋白的高效表达系统,β2微球蛋白可溶性高,稳定性好,与国际通用校准品互通性好,可充分满足该产品诊断试剂制备的需求.
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人谷草转氨酶的基因改造及高效重组表达
目的构建人谷草转氨酶（AST）高效重组表达体系。方法优化编码人 AST的核苷酸密码子，合成人 AST新的基因，并将其克隆至 pRSF-Duet表达载体中，转化大肠杆菌 BL21，以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白的表达，并通过改变诱导剂浓度、振摇速度及诱导温度优化表达条件，以产生可溶性蛋白。可溶性蛋白经镍离子柱亲和层析及分子筛层析纯化，以 SDS-PAGE电泳及蛋白质免疫印迹鉴定蛋白的性质，对重组蛋白的活性及在血清基质中的稳定性进行检测。结果经过优化的 AST密码子在大肠杆菌中的使用频率均在10%以上；重组蛋白存在于上清和沉淀中，经表达优化，在 IPTG终浓度为2 mmol/L、25℃、150 r/min振摇8 h诱导条件下，可增加可溶性蛋白的产率，纯化后的目的蛋白经电泳及免疫印迹鉴定为谷草转氨酶，活性可达136000 U/L，且在含有蛋白酶抑制剂的血清中稳定存在。结论通过密码子优化，成功构建了重组 AST的高效表达系统，重组蛋白可以达到作为参考物质原料的要求。
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探讨具有溯源性和互换性的校准品在临床生化应用中的重要性
由于各试剂生产厂家选择的缓冲液的种类和浓度以及样本／试剂体积比不同，加之不同生化分析仪比色杯光径的精密度和反应槽恒温性能的不同，使得血清酶常规检测系统之间的结果有差异。不同试剂生产厂家校准品的制备不同，以及校准品赋值过程的不同，更是加大了检测结果间的差异。为使血清酶定量测定的结果具有可比性，国际临床化学和医学实验室联盟（ International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine ，IFCC）研究并建立多个酶学检测的参考方法，并研究开发参考物质等。但在大家都一味的强调这样的标准化的同时却忽略了校准品的互换性。著名的标准化专家 Miller 和参与 ERM470参考物质制备的Zegers 都提出了校准品互换性的重要性和目前仍存在的问题［1－2］。
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临床检验参考测量系统和临床检验质量分析
临床检验结果的可比性与可靠性不会受到检验地域和时间等因素的影响，相关临床检验结果能够为各类疾病的临床治疗提供可靠依据，这也是临床检验人员研究的主要方向。从目前临床检验的发展情况来看，尽管临床检验原理较多，但相应的检验方法则较为单一，而不同的实验室检查和临床检验则无法通过相同的方法完成，且有效的临床检验结果可靠性评价方法，以及系统的临床检验结果计量方法，对于临床检验质量具有十分重要的意义。本文就对临床检验中参考测量系统的基本内涵进行了分析，在此基础上探讨了临床检验中相关影响因素，以及临床检验中参考物质应用方法和临床检验质量中实验室规范化管理的基本措施。
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体外生物诊断试剂参考物质的现状与发展
目的 介绍国内外体外生物诊断试剂参考物质的研究现状与进展.方法 通过查阅和分析国内外文献、相关法规,对世界卫生组织和中国体外生物诊断试剂参考物质的管理情况和目前主要的生物诊断试剂参考物质进行总结.结果与结论 世界卫生组织可提供多种生物诊断试剂参考物质,但该类参考物质的研究和管理仍需进一步加强和完善.
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核酸检测参考物质研究进展
1.核酸检测用参考物质的等级及溯源性由于核酸不能单独应用物理和/或化学的方法进行准确描述,因此必须应用生物学反应来补充描述其特性,所以迄今为止传统意义的一级参考测量程序(物理和化学方法)和一级参考物质在NAT检测中尚未出现.
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抗菌药物细菌耐药性监测参考物质标准化研究
抗菌药物的滥用现象十分严重,导致细菌耐药性增加,临床疗效减低,毒副作用增加,造成大量经济损失.目前各医疗、预防、科研单位皆采用国际公认的k-B法进行药敏实验以期指导临床用药和开展耐药性监测.但我国药敏试验材料混乱,测得结果重现性差,相互之间无可比性,试验失去应有的作用.经过几年的研究,我们研制出了符合国际标准的药敏实验标准物质,并获1989年卫生部年科技进步三等奖,现已推广应用.
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凝血因子Ⅷ和Ⅸ活性检测参考物质的互通性研究
目的 评价凝血因子Ⅷ(FⅧ)和Ⅸ(FⅨ)活性国内常用检测系统的结果可比性以及参考物质的互通性.方法 参照美国临床实验室标准化协会(CLSI) EP-30文件和行业标准WS/T 356-2011的互通性评价方法进行实验.将不同浓度水平且覆盖临床检测范围的FⅧ和FⅨ活性检测样本,5个批号自制参考物质(F20140601 ～ F20140605)和英国国家生物制品检定所(NIBSC)标准品(SSCLOT4)分别用Stago STA-R Evolution、IL ACL TOP700和Sysmex CA7000全自动凝血分析仪及配套试剂进行FⅧ和FⅨ活性检测.3个检测系统依次进行2个系统间的结果比较.分别对2个系统临床样本的检测结果进行线性回归并计算偏差,以相关系数和偏差超出可接受范围的样本比例评价检测结果的可比性.剔除偏差超出可接受范围的结果后,再次进行线性回归并计算临床样本检测结果对应Y预测值双侧95％预测区间,绘制互通性评价图对自制参考物质和NIBSC标准品的互通性进行评价.结果 临床样本FⅧ和FⅨ浓度的分布范围为0.5％～ 218.0％和1.6％～156.5％,能够覆盖临床常见浓度水平和满足参考物质互通性评价的要求.不同系统FⅧ和FⅨ检测结果的R2为0.89 ～0.94和0.81～0.93,偏差超出可接受范围的比例均＜10％,可认为3个系统FⅧ和FⅨ活性检测结果的可比性可被接受.根据可比性偏差可接受范围,删除偏差超出可接受范围的临床样本检测结果后,FⅧ活性检测分别有42份、41份和45份临床样本的结果用于自制参考物质和NIBSC凝血标准品的互通性分析,FⅨ活性检测分别有44份、42份和41份临床样本的结果用于互通性分析.5个批号10支自制参考物质和NIBSC凝血标准品的检测结果均落在95％预测区间内,表明其在3个检测系统间均具有互通性.结论 对于FⅧ活性检测,不同检测系统间的结果可比性较好,FⅨ活性检测系统间的可比性尚可接受.自制参考物质和NIBSC标准品用于不同检测系统具有互通性.
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回归和多元分析在参考物质互换性研究中的应用
目的 探讨回归和多元分析在参考物质互换性研究中的应用.方法 参照美国临床和实验室标准化研究院(CLSI) C53-A及相关文件,结合实际工作总的实例进行分析总结,应用回归分析和多元分析评价参考物质互换性.结果 用于参考物质互换性评价的回归方法有普通小平方法(OLS)、戴明(Deming)和Passing-Bablock(PB),具体的实施可通过建立95％预测区间和标准差的倍数进行分析.多元统计主要适用于没有参考方法的多种方法比较.结论 临床实验室应该根据具体的互换性评价研究计划和实际情况选择合适的统计方法.
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脂蛋白(a)检测的标准化
脂蛋白(a)[Lp(a)]是重要的心血管疾病风险预示因子,但各临床实验室间Lp(a)检测结果缺乏可比性限制了其在临床上的广泛应用.尽管在2003年就已建立了Lp(a)的参考方法并确定了参考物质,但直到近才在市场上出现了真正以nmol/L表达检测结果的商品化试剂,其结果可溯源至世界卫生组织(WHO)/国际临床化学和检验医学联合会(IFCC)SRM 2B.文章简述了Lp(a)检测结果不一致的原因以及Lp(a)的标准化工作,同时介绍了罗氏公司在美国华盛顿大学西北脂类与糖尿病研究实验室(NWLRL)Marcovina教授的指导下,消除了Lp(a)内载脂蛋白(a)[apo(a)]环饼(kringle)结构对检测的影响,使常规检测系统可溯源至WHO/IFCC SRM 2B,从而使Lp(a)检测结果具有可比性.这也是在临床实验室免疫学检测方法设计中很少见的一个示例.
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血清雌二醇和睾酮标准物质候选物同步稳定性研究
目的 按照GB/T 15000.3-2008/ISO Guide35(2006)的说明,用同步稳定性实验设计对血清雌二醇和睾酮标准物质候选物在不同保存条件下的稳定性进行研究.方法 以实验初始时间为时间零点,-196 ℃液氮保存为参比温度条件,共设计13种温度时间点计划.将标准物质候选物混合人血清置于-70℃、-20℃、4℃和室温的环境下分别保存1周至28个月.全部储存和转移工作完成后,用常规方法在一个工作日内完成所有样本的测定.结果 血清睾酮和雌二醇在-70℃至少稳定保存28个月,在-20℃可稳定保存12个月.在室温保存1个月,4℃下保存2个月,血清中两个项目的浓度存在下降的趋势,经统计学检验该变化具有显著性.结论 血清雌二醇和睾酮标准物质候选物长期稳定贮存的条件为-70℃冰冻保存.
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生化检测系统及其量值溯源
目前常以室间质量评价作为判断准确性的依据,这种做法虽可使测量结果一致,但却可能不准确.一致性是准确性的基础,不准确的一致性比个别的不一致性危害更大.测量结果的溯源性是保证准确的重要方法.如何实现自建生化检测系统检测结果的溯源以及可比,是急需解决的问题.
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第七届(2011年)检验医学参考系统研讨会会议纪要
第七届(2011年)检验医学参考系统研讨会,由卫生部临床检验中心主办,浙江清华长三角研究院承办,于201 1年10月16日～21日在浙江省嘉兴市召开.本次会议围绕"巩固标准化,开展一致化"的研讨主题,讨论了参考测量实验室的建设与认可、测量不确定度的评定、参考测量程序与参考物质的研究等参考系统方面的新进展,探讨了借鉴国际经验、利用国内参考实验室网络、建立国家标准化的可行性,介绍了开展一致化的试点经验.
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红细胞比容国家一级标准物质的研制
目的 研制红细胞比容国家一级标准物质,作为红细胞比容检测结果溯源的标准.方法 新鲜血经稳定化处理、调整浓度后分装成待评价的标准物质;参照ISO Guide 35(2006版)和《一级标准物质技术规范》的要求进行均匀性和稳定性评价,使用直接溯源至参考方法的标准仪器对标准物质进行定值;对标准物质的均匀性、稳定性和定值过程引入的不确定度进行评定,计算合成标准不确定度和扩展不确定度;将一级标准物质与二级标准物质的不确定度进行比较.结果 标准物质的均匀性评价方差分析结果显示P＞0.05,表明标准物质是均匀的;瓶间均匀性的标准不确定度ubb为0.22％.12周内稳定性评价趋势分析结果显示P＞0.05,表明该期限内标准物质是稳定的;长期稳定性的标准不确定度ults为0.27％.定值结果的标准不确定度uchar为0.59％;合成并扩展不确定度后,定值结果的表达式为(38.7±1.4)％.一级标准物质的相对不确定度(3.6％)小于国家二级标准物质(4.8％).结论 标准物质的均匀性和稳定性良好,定值方法可靠.
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血细胞分析国家一级标准物质的研制
目的 研制血细胞分析国家一级标准物质,作为血细胞分析检测结果溯源的标准.方法 新鲜血经稳定化处理、调整浓度后分装成待评价的标准物质；参照ISO Guide 35(2006版)和《一级标准物质技术规范》的要求进行均匀性和稳定性评价,使用直接溯源至参考方法的标准仪器对标准物质进行定值；对标准物质的均匀性、稳定性和定值过程引入的不确定度进行评定,计算合成不确定度和扩展不确定度；将一级标准物质与二级标准物质的不确定度进行比较.结果 标准物质WBC、RBC、Hb和PLT 4个参数的均匀性评价的方差分析结果均显示P＞0.05,表明标准物质是均匀的；瓶间均匀性的标准不确定度分别为0.04×109/L、0.022×1012/L、0.1 g/L和2.2×109/L.26周内各参数的稳定性评价趋势分析结果均显示P＞0.05,表明该期限内标准物质是稳定的；长期稳定性的标准不确定度分别为0.08×109/L、0.023×1012/L、1.1 g/L和3.6×109/L.定值结果的标准不确定度分别为0.09×109/L、0.059×1012/L、1.2 g/L和4.1×109/L;合成并扩展不确定度后,定值结果表达式分别为(5.4±0.3)×109/L、(4.42±0.13)×1012/L、(137±3)g/L和(187±12)×109/L.一级标准物质各参数的不确定度均明显小于国家二级标准物质.结论 标准物质的均匀性和稳定性良好,定值方法可靠；各参数定值结果的不确定度明显小于国家二级标准物质.
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自制红细胞沉降率检测参考物质的评价与初步应用
目的 对自制红细胞沉降率检测参考物质进行评价,并试用于室内质量控制.方法 以新鲜动物血为原料,对红细胞进行洗涤和固定,与模拟血浆混合配制成6个批号(ESR01～ESR06)不同沉降率水平的参考物质.参照ISO Guide35和CNAS-GL03的要求,对自制参考物质和2个批号进口质控物(QC01～QC02)进行均匀性和稳定性评价,并选择3个批号的自制参考物质应用于不同检测系统的室内质量控制,整个过程同时检测进口质控物并进行比较.结果 均匀性评价结果显示,各批号自制参考物质和进口质控物均匀性良好,瓶间差异无统计学意义(P＞0.05),沉降率相近的自制物质和进口质控物瓶间均匀性不确定度分别是0.2～1.0 mm/h和0.8～1.5 mm/h.参考物质检测后分别置于室温和冷藏条件,4周内多次重复检测的结果均无趋势性变化(P＞0.05),在室温放置时,沉降率随时间变化偏差均在评价标准允许范围内,但在冷藏条件放置时,ESR02、ESR03,ESR04和QC02批号物质沉降率变化的相对偏差分布范围均超出评价标准.自制物质在冷藏条件长期保存,在观察期25周内,自制参考物质和进口质控物检测结果无趋势性变化(P＞0.05),沉降率相近的自制和进口质控物长期稳定性不确定度分别是0.1～3.0 mm/h和1.0～2.9 mm/h,沉降率随时间变化的偏差均在评价标准允许范围内.室内质量控制应用结果显示,自制参考物质与沉降率相近的进口质控物检测结果的CV接近.结论 自制血沉参考物质均匀性、稳定性良好,室内质量控制试应用效果良好.
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盐碘参考物质的研制及应用
食盐加碘是我国防治碘缺乏病的一项基本措施,为提高各地盐碘测定的质量,加强盐碘测定的质量管理,确保碘盐测定的准确性和资料可比性,我们曾于1995年开始了盐碘参考物质的研制.按照国家有关标准物质研制的规范要求,主要解决参考物质的准确性,均匀性和稳定性,按国家标准物质定值方法定值,按统计学方法处理数据,确定参考物质参考范围.该参考物质已应用于1995,1997,1999年连续三年的全国碘缺乏病病情监测中的盐碘测定实验室的质量评估.现将该参考物质的研制及应用报告如下:
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临床酶学标准化的研究
临床实验室的首要目的是通过厂商试剂获取有利于疾病诊断、治疗和监控的信息,而检测结果应该在时间和空间上具有可比性.自20世纪50年代以来,酶学测量逐步应用于临床检验和诊断领域,从手工检测到全自动检测系统,从原理单一化到方法多样化,临床酶学已历经50多年的发展历程.
