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巨噬细胞抑制因子在毕赤酵母中的表达及鉴定
目的:在毕赤酵母表达系统中获得巨噬细胞抑制因子(MIC-1)高效分泌表达,并鉴定其免疫活性.方法:从BeWo细胞系中提取总RNA,通过反转录PCR获得目的片段,然后将基因亚克隆人pPIC9k表达载体,线性化后转化GS115酵母细胞,经G418抗性筛选获多拷贝重组子并诱导表达,PCR鉴定目的基因的整合.表达产物用Western blot鉴定生物活性.结果:经过G418筛选到34株阳性克隆,MIC-1蛋白高表达量为6.332mg/L.结论:成功构建了MIC-1表达载体,在酵母中获得多拷贝高效表达,并且形成正确的蛋白结构.
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空肠弯曲菌蛋白糖基化系统及利用该系统在大肠杆菌中表达糖蛋白的研究进展
蛋白质糖基化是蛋白质翻译后的一种重要加工过程,其种类主要有N-糖基化和O-糖基化.N-糖基化是指寡糖链连接在蛋白的天冬酰胺β-酰胺氮上,O-糖基化是指寡糖链连接在蛋白的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的羟基的氧原子上.自从1976年在古细菌中发现S-层糖蛋白以来,已经在古细菌和细菌中发现70多种糖基化蛋白[1-2],并且大部分属于O-糖蛋白,是细菌鞭毛或纤毛的组成成分[3].人体内超过一半的蛋白质是糖基化蛋白质[4],糖基化蛋白质的糖链在机体的正常生理活动中具有重要功能和作用[5].蛋白质药物的糖基化可以增强蛋白质药物的生物活性、延长其半衰期、增加其溶解性、改善其免疫原性等,目前70%的治疗性蛋白质药物均是糖蛋白[6-7 ].生产糖蛋白的首选宿主是中国仓鼠卵巢细胞,生产效率低,成本高,部分蛋白糖链具有免疫原性;另外,毕赤酵母表达系统和昆虫细胞也可以用来生产糖蛋白,但这两种表达系统生产的糖蛋白的糖链为高甘露糖型或含有杂糖,具有较强的免疫原性.大肠杆菌表达系统是应用广泛的经典表达系统,该系统缺乏真核细胞所特有的蛋白质翻译后的糖基化修饰过程,一直以来该系统只能表达非糖基化蛋白质.然而,近10年来发现空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)中存在糖蛋白,把空肠弯曲菌中存在的蛋白糖基化相关基因转化到大肠杆菌中则能够在大肠杆菌中表达带有糖链的目的蛋白.本文对空肠弯曲菌中存在的糖基化系统和利用该系统在大肠杆菌中表达带有糖链的目的蛋白的研究进展进行综述.
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乙型肝炎表面抗原颗粒在毕赤酵母中的表达
毕赤酵母表达系统是一个高效异源蛋白表达工具,表达载体直接整合到酵母基因组上,可以产生遗传稳定的重组子,有类似于哺乳动物翻译后加工修饰的功能,可在成本低廉的无机盐培养基中进行高密度培养生产重组蛋白[1,2].为提高重组菌株表达的稳定性,本研究选用毕赤酵母表达系统,成功地表达了22 nm HBsAg颗粒,为在毕赤酵母中开发生产乙肝疫苗提供了资料.
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毕赤酵母表达系统及其在我国病原生物学领域的应用进展
本文概述了毕赤酵母表达系统及其在病原生物学领域的应用进展,主要阐述了毕赤酵母表达系统的构成、其表达外源蛋白的优越性以及该系统的应用现状.
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HPV16 L1在整合型重组毕赤酵母中的表达及病毒样颗粒的纯化
目的 构建可稳定表达HPV16 L1的整合型重组毕赤酵母,并纯化自主组装成的HPV16 L1病毒样颗粒(VLPs).方法 根据酵母密码子偏爱性优化HPV16 L1基因并克隆到pPIC3.5K表达载体,构建pPIC3.5K/HPV16 L1重组质粒;重组质粒经Bgl Ⅱ酶切线性化后,电转化至GS115菌株中,筛选HPV16 L1重组毕赤酵母.阳性整合菌株甲醇诱导后,以HPV16 L1单克隆抗体检测目的蛋白表达;采用肝素亲和层析法纯化HPV16 L1VLPs并进行透射电镜观察.结果 PCR、酶切和测序分析表明成功构建了pPIC3.5K/HPV16 L1重组质粒.成功构建的HPV16 L1重组毕赤酵母甲醇诱导后,Western blot证实重组酵母菌裂解产物存在HPV16 L1目的蛋白.肝素亲和纯化后,透射电镜观察到了直径大约55 nm的VLPs,其形态与HPV16天然病毒颗粒相似.结论 利用整合型重组毕赤酵母表达系统成功表达了HPV16L1蛋白,并用肝素亲和纯化可快速获得结构完整的HPV16 L1VLPs,为HPV16预防性疫苗的研制奠定基础.
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复合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性研究
目的 构建天蚕素A-死亡素复合基因工程抗菌肽基因CA(1-7)-T(4-19) ,并在毕赤酵母中表达.方法 采用重叠区基因扩增法(SOE)人工合成复合肽基因,同载体 pPICZαA 连接后转化毕赤酵母受体菌X-33 ,通过博莱霉素抗性筛选得到的阳性克隆用甲醇诱导表达,并对产物进行抗菌活性检测,建立抗菌谱.结果 复合肽基因CA(1-7)-T(4-19)成功克隆到载体pPICZαA上,鉴定结果与预先设计的基因序列一致,在甲醇诱导下复合肽基因得到表达,并得到临床分离的76株革兰阴性和革兰阳性耐药致病菌的小抑菌浓度,小抑菌浓度可达到5 μg/mL.结论 成功获得了具有抑菌活性的复合基因工程抗菌肽,且该复合肽对临床常见多重耐药菌株均有明显的抑杀作用.
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细菌素的抗细菌耐药研究及应用现状
随着青霉素等抗生素的问世，人类因细菌感染所致疾病的死亡率大为降低；但在抗生素广泛应用至今，我们又面临着细菌耐药日趋严重、耐药菌感染难以控制、新抗生素研发脚步迟滞的严峻局势。如何应对这一全球性的难题，研究者们殚精竭虑，力求在抗生素以外寻求新的突破，有着比抗生素更悠久历史、同样具有抗菌活性的细菌素引起了研究者们的重视。但抗菌谱、产量等问题使细菌素的应用受到了限制，打破瓶颈成了当下研究的热点。本文主要对细菌素的研究现状、应用及异源表达做了相关综述。
