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利用肠激酶加工融合蛋白的方法制备rhlL-11
本研究探讨利用肠激酶加工融合蛋白的方法制备重组人白细胞介素11(rhIL-11)的工艺条件与参数.融合表达载体pET32a/IL-11在大肠杆茵E.coli BL21(DE3)pLysS中诱导表达,裂解上清以Ni-NTA亲和纯化,通过DsbA-EKL-(His)8的自催化切割完成单体活性肠激酶催化亚基的释放,继而对Trx-IL-11行使酶促切割作用制备rhIL-11.结果表明:亲和纯化得重组融合蛋白Trx-IL-11 11.25 mg/g湿菌,产品纯度达89.2%,回收率为91.8%.酶切体系经Ni-NTA resin充分吸附后,目标产品单体rhIL-11纯度大于95%.结论:利用肠激酶加工融合蛋白以制备rhIL-11的方法简单可行,分离纯化效果好,能够满足工业生产的需要.
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黄曲霉毒素B1抗原模拟表位高效表达
目的 构建黄曲霉毒素B1(AFB1)模拟表位pⅧ噬菌体展示载体,为建立无毒害免疫学检测方法提供依据.方法 构建呈现AFB1抗原模拟表位的噬菌体载体,并引入肠激酶酶切位点,诱导表达,肠激酶处理重组噬菌体颗粒,酶联免疫吸附法鉴定反应原性.结果 重组质粒酶切谱、PCR扩增结果及测序结果均与设计一致,在pC89载体中插入了GACGACGACGACAAGCATCCTAGTGATCCGCGTCATGGG序列,肠激酶处理后的重组噬菌体颗粒可与AFB1抗体特异性结合,吸光度(A)值可达2.112.结论 成功构建了包含肠激酶酶切位点的AFB1抗原模拟表位pⅧ噬菌体表达载体,重组噬菌体颗粒经初步表达有一定反应原性.
关键词： 黄曲霉毒素B1(AFB1) 模拟表位 pC89 肠激酶 -
胰腺炎及胰源性糖尿病的认识及处理
1 急性胰腺炎(Acure pancreatitis) 是胰酶在胰腺内被激活后引起胰腺组织自身消化性炎症.正常情况下,胰腺分泌的以前体或酶原形式存在的无活性的酶,胰液进入十二指肠后,在肠激酶作用下酶原等被激活,发挥胰酶的消化作用;由于肠道疾病等病因的存在,破坏了自身防御机制,发生自消化的连锁反应,不仅使胰腺实质炎症、坏死,也对周围组织产生消化、坏死,而且产生一系列炎症介质,氧自由基、白细胞三烯等,致全身及脏器受累.分两型:(1)水肿型:大约50％可致一过性高血糖[1];(2)出血坏死型:会导致持久的空腹高血糖.
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骨形态发生蛋白10在中国仓鼠卵巢细胞中的表达、纯化及其生物活性
目的 在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)中表达改造后的骨形态发生蛋白10(bone morphogenetic protein 10,BMP10)全长基因,纯化后检测其生物活性,以期获得具有生物活性的BMP10分子.方法 于rhBMP10的propeptide与mature chain基因片段之间插入6×his-tag标签及DDDDK(肠激酶识别位点),构建pMH3-rhBMP10-histag-DDDDK质粒,电转入CHO细胞,用500 μg/ml G418从单克隆中筛选出稳定表达目的蛋白的重组细胞,悬浮驯化表达8d后,收集培养液上清,阴离子交换柱和镍柱纯化目的蛋白.采用q-PCR法检测纯化蛋白的体外细胞活性.结果 目的蛋白纯化液经SDS-PAGE检测到的条带相对分子质量与目的蛋白理论值相符,Western blot分析可见相对分子质量约48 000、96 000和190 000的3个条带,与目的蛋白单体及多聚体相对分子质量一致.酶切后的目的蛋白可有效刺激P19细胞的标志蛋白(Smad6)表达上调.结论 BMP10 propeptide的存在对BMP10的蛋白活性具有重要作用,改造后的BMP10在CHO细胞中表达具有一定的生物活性.本研究为全长BMP10活性二聚体的制备提供了新的思路.
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全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其活性
目的 在毕赤酵母中表达全长甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)(1-34)与人血清白蛋白(Human serum albumn,HSA)的融合蛋白PTH(1-34)-HSA,并检测其活性.方法 在质粒pPIC9K-PTH(1-34)2-HSA的基础上设计引物,引入6His标签及肠激酶酶切位点,从该质粒中扩增6His-EK-PTH(1-34)-HSA基因,插入pPIC9K载体中,构建重组表达质粒pPIC9K-6His-EK-PTH(1-34)-HSA,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达；表达的6His-PTH(1-34)-HSA融合蛋白通过两步亲和层析纯化和肠激酶酶切,获得全长的PTH(1-34)-HSA融合蛋白；检测融合蛋白对UAMS-32P成骨细胞增殖活力、碱性磷酸酶活性以及RANKL和OPG基因转录水平的影响.结果 重组表达质粒经测序证实构建正确；表达的6His-PTH(1-34)-HSA融合蛋白相对分子质量约70 000,可与PTH抗体和HSA抗体特异性结合,发酵 获得的融合蛋白的浓度为200 mg/L;纯化的融合蛋白可与抗PTH、HSA和6His标签抗体特异性结合,经肠激酶酶切后,该蛋白失去了与6His抗体反应的能力,保持了与PTH和HSA抗体结合的能力；酶切后的全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白保持了PTH的生物活性,能促进UAMS-32P成骨细胞的增殖活力,提高细胞的碱性磷酸酶的活性,上调细胞RANKL基因的转录水平以及抑制OPG基因的转录水平.结论 成功在毕赤酵母中表达了全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白,有望提高PTH的成药性.
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急、慢性胰腺炎发病机制的早阶段变化
胰腺腺泡是胰腺炎早发生形态学变化的场所,当摄取高脂肪、高蛋白及大量饮酒的食糜进入小肠时,十二指肠Ⅰ型细胞即分泌胆囊收缩素(CCK),迅速激活了腺泡内的酶原颗粒,其中胰蛋白酶原受蛋白分解酶肠激酶的作用转变为具活性的胰蛋白酶,然后胰蛋白酶又将前弹力酶、羧基肽酶原、非活性型磷脂酶A2激活转变为其活性型.生理情况下也有少量胰蛋白酶,但由于存在大量胰蛋白酶抑制物,又有不利于酶分解的酸性pH,这就使少量胰蛋白酶不致损伤腺泡.当急性胰腺炎患者就诊时,这些早阶段的变化已然过去,现有的相关知识都来自胰腺炎动物模型和分离腺泡的研究.
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重组肠激酶酶切Trx-rPA融合蛋白的研究
重组肠激酶(rEK)酶切重组硫氧还蛋白瑞特普酶融合蛋白(Trx-rPA),环境pH较高,rEK的酶切活性也较强,但融合蛋白裂解后产生的瑞特普酶(rPA)易转化成降解rPA.Lys对rEK酶切Trx.rPA的活性及对rPA向降解rPA的转化均无抑制作用.氨基己酸对rEK酶切活性的抑制作用与Arg相似,但对rPA有较好的保护作用.
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抗人甲胎蛋白单链抗体融合蛋白的构建、表达及初步鉴定
甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)是重要的肝癌诊断标记物,在肝癌的进展过程中扮演重要角色.构建具有免疫学活性的抗人AFP单链抗体,为进一步的研究奠定实验基础.采用RT-PCR技术,从分泌抗人AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞中扩增mAb抗体可变区的VH、VL基因,并进一步将其组装成VH-Linker-VL型的ScFv片段.将ScFv片段亚克隆至质粒pET32a中,将重组质粒转染大肠杆菌BL21并IPTG诱导表达ScFv蛋白,利用肠激酶切除Trx标签后,经镍柱亲和层析获得蛋白,竞争抑制ELISA法初步鉴定活性,竞争抑制率达到54.13％.
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肠激酶特点及其基因工程的研究进展
肠激酶是从哺乳动物体内提取的一种丝氨酸蛋白酶,广泛应用于基因T程领域切割融合蛋白.文章对肠激酶的特点及其基因工程研究进展进行了综述.
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具有自激活切割活性肠激酶轻链基因设计、表达及活性研究
目的 获得Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列+牛EKL的cDNA序列,实现EKL基因在大肠杆菌中的融合表达和自切割.方法 用Trizol法从牛十二指肠组织中提取总RNA.利用RT-PCR技术扩增其cDNA片段,将此片段克隆于表达载体pGEX-2T,并在其前引入肠激酶(EK)识别序列.结果 所表达蛋白经SDS-PAGE分析.相对分子质量约为61 000,经GST-Sepharose亲和色谱柱纯化后得到单一蛋白,SDS-PAGE显示单一条带,用微量EK引发自切割,切断GST标签蛋白和Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列,采用对氨基苯甲脒-Sepharose亲和色谱获得了轻链EK的单体.结论 成功地克隆、表达了牛EK轻链基因,采用自激活、切割获得了EK单体,每1 L培养基获得EK 5 mg,为进一步进行重组牛EK活性的研究及应用奠定了基础.
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尿胰蛋白酶原-2在急性胰腺炎诊断中的价值探讨
在正常生理条件下,小肠腔内的肠激酶分解胰蛋白酶原.急性胰腺炎时胰蛋白酶原在胰腺实质内活化,所产生的胰蛋白酶原激活降解产物通过胰腺渗入腹腔,进入血液循环再随尿排出.急性胰腺炎病人的尿胰蛋白酶原-2浓度显著升高,可用尿快速试纸条试验进行检测,其对急性胰腺炎的诊断价值评估如下.
