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氯霉素驱动的β-半乳糖苷酶互补体系的构建
目的 构建氟霉素驱动的β-半乳糖苷酶(β-gal)互补体系,以期建立氯霉素残留检测用非竞争性均相酶互补免疫分析系统(OS-ECIA).方法 从大肠杆菌DH5α和BL21株分别克隆β-gal△α和△ω基因,采用重叠延伸PCR组装含抗氯霉素抗体可变区的互补肽融合蛋白,在T7启动子驱动下于大肠杆菌宿主株中表达,表达产物纯化与复性后进行酶互补活性分析.结果 成功克隆和高效表达融合肽基因VH-CAP-△α和VL-CAP-△ω,表达产物为包涵体蛋白,经纯化和复性后呈现特征性酶学互补活性,且酶活性呈现氯霉素依赖性增加.结论 成功构建氯霉素驱动的β-gal互补体系.
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抗体重链可变区框架Ⅰ区对抗体分泌的影响
抗体重链可变区框架Ⅰ区(FR-Ⅰ)对抗体在原核细胞中的分泌表达具有显著的影响,单个氨基酸的改变即可导致抗体分子分泌能力的丧失.为了探索抗体在哺乳动物细胞中的高效表达,我们对一株不能有效分泌的人源抗狂犬病病毒抗体pCMV-RV/VH的FR-Ⅰ区氨基酸编码基因进行定点突变研究.实验显示,抗体重链可变区FR-Ⅰ区H6位的氨基酸由Glu突变为Gin之后,抗体的分泌表达水平得到了显著的提高,并且与抗原特异性结合的能力也明显增强.通过免疫荧光法对抗体在细胞内的转运过程进行了初步的探讨,发现能够有效分泌的抗体与无分泌表达的抗体都能够在细胞内进行正常的转录和翻译,进入内质网并转运至高尔基体,而且胞内表达水平基本一致.我们认为分泌能力的不同可能是FR-Ⅰ区影响抗体分子的折叠与装配所致,其中该区H6位氨基酸的性质能够显著影响抗体在哺乳动物细胞中的分泌.本研究以抗体重链可变区FR-Ⅰ区氨基酸为焦点,对基因工程抗体在真核细胞中高效表达的影响因素进行了探索,为改进抗体规模化生产提供了依据.
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抗胃癌抗体重链可变区序列分析及空间结构模拟
目的:通过序列分析确定抗胃癌抗体重链可变区(VH)的一级结构,并借助同源模建方法模拟其三级结构.方法:从抗人胃癌噬菌体抗体库中筛选出VH基因,并进行序列测定、翻译和分析.利用计算机辅助蛋白质空间模拟技术,采用同源模建、力学优化合理模建VH的三维空间结构.结果:序列比对分析表明获得的VH序列符合鼠抗体可变区特征,通过Kabat分析确定了FR、CDR;合理搭建了抗体重链可变区的空间构象,并通过分子力学优化获得了稳定的三维结构.结论:所测得的VH一级结构和构建的三维空间结构均有较高的可靠性,为进一步的生物学实验奠定了基础.
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抗胃癌抗体轻链可变区序列测定和三维结构模建
目的:确定抗胃癌抗体轻链可变区(VL)的一级结构,并模建其三级结构.方法:从抗人胃癌噬菌体抗体库中筛选出VL基因,并进行序列测定和分析.利用同源蛋白结构模建技术,采用计算机辅助分子设计系统模建VL的三维空间结构.结果:所获得的VL序列符合鼠抗体可变区特征,并成功构建了其三维空间结构.结论:所测得的VL一级结构和构建的三维空间结构均有较高的可靠性.
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抗体可变区稳定性评价及其初步应用
目的：通过研究抗体轻、重链间的结合能与其构象特征、理化性质间的内在关系，建立相应的数学模型，合理评价抗体分子的热稳定性，为抗体分子的设计、合理改造及亲和力成熟奠定基础。方法采用生物信息学和计算生物学相关方法对已有晶体结构的抗体结构信息进行分析，通过距离几何学、计算机图形学技术对抗体可变区的构象特征进行研究；基于分子间氢键形成理论、反应自由能理论，从热力学、动力学对抗体分子轻、重链可变区相互作用的动态结构及能量特征进行探讨；借助统计学原理、非线性拟合、回归分析等分析手段对抗体轻、重链作用能与其构象特征、理化性质建立相关性分析。结果通过分子模拟与统计学分析，抗体的轻、重链可变区结合能与其轻、重链间的氢键形成数目、范德华作用均存在线性相关性；与抗体理化性质存在基于多项式的非线性相关性。基于关键位置氨基酸的使用频率以及建立的分析模型，针对无法获得稳定工程细胞株的抗蓖麻毒素人源化功能抗体进行合理的评价及优化，借助理论指导，获得抗蓖麻毒素人源化抗体稳定的工程细胞株。结论抗体可变区的自身结构（构象、理化性质）对其稳定性有很大影响，可以通过抗体结构优化来提高抗体的稳定性。
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抗人甲胎蛋白单链抗体融合蛋白的构建、表达及初步鉴定
甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)是重要的肝癌诊断标记物,在肝癌的进展过程中扮演重要角色.构建具有免疫学活性的抗人AFP单链抗体,为进一步的研究奠定实验基础.采用RT-PCR技术,从分泌抗人AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞中扩增mAb抗体可变区的VH、VL基因,并进一步将其组装成VH-Linker-VL型的ScFv片段.将ScFv片段亚克隆至质粒pET32a中,将重组质粒转染大肠杆菌BL21并IPTG诱导表达ScFv蛋白,利用肠激酶切除Trx标签后,经镍柱亲和层析获得蛋白,竞争抑制ELISA法初步鉴定活性,竞争抑制率达到54.13％.
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抗CD4单克隆抗体可变区基因克隆及序列分析
抗CD4单抗可延长灵长类动物模型同种器官移植物的存活时间和改善实验性自身免疫疾病的病情[1].在人类,抗CD4单抗已被成功地用来治疗类风湿性关节炎[2]、系统性红斑狼疮[3]等自身免疫性疾病和肾移植患者的急性和慢性排斥反应[4].本文对抗CD4单克隆抗体VH和VL基因进行了克隆和序列分析,为其嵌合抗体的构建、表达奠定了基础.
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抗SEB单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的基因构建和表达
目的 从分泌抗SEB的单克隆抗体(FMU-SEB-No.1)杂交瘤细胞中,克隆出FMU-SEB-No.1重链和轻链可变区(VH和VL)基因,构建FMU-SEB-No.1单链抗体(scFv)的原核表达载体,并进行scFv基因的蛋白表达.方法 从FMU-SEB-No.1杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR扩增出VH和VL基因；通过在引物上设计linker序列,拼接VH和VL为完整FMU-SEB-No.1的scFv基因(FMU-SEB-scFv).将测序正确的scFv基因克隆入PGEX4T-1载体,转化入E.coli BL21(DE3)进行蛋白表达.通过SDS-PAGE,Western blot法分析其表达水平和特异性,酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定其抗原结合活性.结果 测序结果显示,本实验成功克隆出FMU-SEB-No.1重链及轻链可变区基因,并成功构建FMU-SEB-scFv基因,所得的基因全长为750 bp,编码250个氨基酸.SDS-PAGE和Western blot分析表明,PGEX4T1-FMU-SEB-scFv在E.coli BL21(DE3)可表达为Mr约54 000的可溶型scFv/GST融合蛋白.间接ELISA检测结果表明,可溶型scFv/GST融合蛋白与SEB具有较高的抗原结合活性.结论 制备并鉴定了针对SEB的基因工程抗体,为开发出针对SEB的治疗性抗体奠定了实验基础.
