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杆状病毒昆虫细胞表达系统文献资料
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H5N1高致病性禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达
目的:扩增高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因,并进行真核表达.方法:抽提毒株A/Jiangsu/08-6基因组RNA,反转录为cDNA,用特异性引物扩增HA基因.HA经BamH I/Xho I双酶切后克隆到pFastBacGP67B载体上,筛选出阳性重组转座质粒pFastBac-GP67B-HA,并将其进一步转化DH 10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定后,获得重组穿梭载体(rBacmid-HA),再通过CellfectinⅡ试剂转染rBacmid-HA至对数生长期的sf9昆虫细胞,进行目的蛋白的真核表达.分别用SDS-PAGE、Western blot、血凝试验以及质谱分析对其进行鉴定.结果:HA基因在sf9细胞表达的蛋白分子量约70 000.血凝试验表明重组HA蛋白可使鸡红细胞发生凝集.质谱分析鉴定该重组蛋白为HA蛋白.结论:重组HA蛋白具有天然HA蛋白的活性,为亚单位疫苗的研制及中和抗体的筛选奠定了基础.
关键词： H5N1型禽流感病毒 血凝素 杆状病毒昆虫细胞表达系统 血凝试验 -
表达纯化糖原合成酶激酶3β的两种方法比较
目的 建立一套高纯度、高活性表达糖原合成酶激酶3β的技术.方法 分别采用大肠杆菌和杆状病毒昆虫细胞蛋白表达系统表达糖原合成酶激酶3β,通过His和GST标签两步纯化目的 蛋白,SDS-PAGE观察目的 蛋白的纯度,激酶反应观察目的 蛋白的活性.结果 大肠杆菌表达纯化的糖原合成酶激酶3β占纯化后总蛋白的壁为54%,昆虫细胞表达纯化的糖原合成酶激酶3p占纯化后总蛋白的量为96%;昆虫细胞来源的目的 蛋白比大肠杆菌来源的目的 蛋白活性高-倍左右.结论 相比大肠杆菌表达的糖原合成酶激酶3β,昆虫细胞表达的目的 蛋白具有更高的纯度和活性.
