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血清学和分子生物学证实云南省勐海县存在恙虫病流行
目的 了解云南省勐海县恙虫病流行状况.方法 2011年6-9月,在勐海县采集恙虫病临床诊断和疑似病例急性期和恢复期血液标本,用巢式聚合酶链反应(nPCR)对患者凝血块进行恙虫病东方体(Ot)热休克蛋白(groEL)基因扩增和测序分析.用间接免疫荧光试验(IFA)检测患者血清中Ot-IgG抗体.结果 36例急性期患者凝血块标本经聚合酶链反应扩增,Ot核酸阳性25份,其中14份阳性标本被克隆和测序.同源性和进化分析显示,勐海县14株Ot的groEL区核苷酸同源性为99％ ～ 100％,氨基酸同源性均为100％,它们与来自GenBank的BJ-TZ-OT-O39、AH-GD-OT-S6、UT213、Kato和SH205株之间具有较高的同源性和较近的亲缘关系.17例病例双份血清经IFA检测,其中11例病例的恢复期血清IgG抗体滴度大于急性期血清4倍及以上.根据检测结果,26例病例被诊断为恙虫病(分子诊断15例和血清学诊断11例).结论 首次经血清学及分子生物学证实勐海县存在恙虫病流行.分子流行病学分析表明,勐海县Ot流行株具有稳定的遗传特点和明显的地域特征.
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G6PD缺乏症单细胞SNaPshot基因诊断方法的建立
目的 建立有效可行的葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症单细胞基因诊断技术. 方法 获取正常人及G6PD基因突变杂合子的单个淋巴细胞,采用多重巢式PCR结合多重SNaPshot技术对G6PD基因突变高发的四个外显子上的12个突变位点进行基因诊断. 结果 共检测了58个正常和108个杂合子单淋巴细胞,扩增效率为90.97％,等位基因脱扣率为8.08％. 结论 所建立的多重巢式PCR结合SNaPshot技术可在单细胞水平上快速、准确地检测12个G6PD基因突变位点,可望在临床上实现G6PD缺乏症的植入前遗传学诊断.
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在β地中海贫血着床前遗传学诊断中应用多重置换扩增进行预处理的临床分析
目的 分析应用多重置换扩增技术(multiple displacement amplification,MDA)进行全基因组扩增的预处理是否影响β地中海贫血着床前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)的准确效能. 方法 回顾性地分析2009年1月至2013年6月,因双方均为β地中海贫血携带者而行PGD治疗的周期资料,其中34个周期采用多重巢式聚合酶链反应(PCR)结合反向斑点杂交技术对单细胞进行诊断,另有38个周期行MDA进行全基因组扩增的预处理后,再结合反向斑点杂交技术进行诊断. 结果 两组患者在年龄、获卵数等实验室指标上无统计学差异.MDA组未检出(扩增失败)率为9.79％,低于行巢式PCR组的15.24％,而杂合子率46.33％则略高,但两种方法在诊断结果上并无统计学差异. 结论 应用MDA技术进行全基因组的预扩增可有效增加检测模板,实现多位点及多种疾病的诊断,而且不影响β地中海贫血地贫基因的诊断效能.
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河南省人免疫缺陷病毒1型流行现状研究
目的 了解河南省人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)毒株的亚型状况及序列变异、流行特征,分析其传播来源和传播规律.方法 对2006-2007年在河南省采集的1287例HIV-1感染者抽取静脉血,用巢式聚合酶链反应(nest-PCR)对单个核细胞中前病毒脱氧核糖核酸的env基因和gag基因进行扩增,并测定和分析核苷酸序列.结果 1287份样本中存在B'、C亚型及BC、AE两个重组亚型,其在所有分析样本中的比例分别为95.882%(1234/1287)、0.466%(6/1287)、2.875%(37/1287)、0.777%(10/1287).与国内及国际的参考毒株RL42、C.95in21068、07-BC.CN.97.C54A、01AE.TH.90.CM240间的离散率分别为(9.327±0.245)%、(5.214±0.183)%、(6.278±0.194)%、(5.332±0.1 58)%.结论 目前河南省艾滋病感染者中有B'、C亚型及BC、AE两个重组亚型.泰国B'亚型依然占主导地位.B'亚型以既往有偿献血人员为主,BC亚型以性传播为主,AE亚型以性传播及既往献血途径为主,C亚型以性传播为主.
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滇西横断山区鼠类及蜱自然感染立克次体调查
云南为我国立克次体病流行的主要省份之一，由于其地理环境较为复杂，生物多样性异常丰富，加之近年随着旅游业等人类活动的日益扩张，立克次体病例逐渐增多，尤其是滇西横断山区时有恙虫病和斑疹伤寒的流行［1，2］，为此对滇西横断山区开展立克次体调查，为人群有效防治提供参考依据。
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不同引物对扩增SEN病毒的实验研究
为了解国内SENV的感染状况,根据SENV的5'非编码区和编码区ORF1的保守序列设计引物,采用巢式聚合酶链反应(nPCR)检测SENV,对PCR产物进行序列分析.
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北京地区2006-2010年女性HIV-1感染者流行毒株分子特征研究
目的 分析北京地区女性HIV-1感染者流行毒株分子特征.方法 随机采集2006-2010年北京地区新发现女性HIV-1感染者的抗凝全血标本100份,分离血浆,提取病毒RNA,用反转录/巢式聚合酶链反应扩增病毒gag基因,并进行序列测定和亚型分析.结果 系统进化分析确定北京地区女性HIV-1感染者存在Al(1)、A2(1)、B(3)、B'(23)、C(8)、G(2)、H(1)、CRF01_AE(18)、CRF02_AG(3)、CRF06_cpx(1)、CRF07 BC(14)、CRF08_BC (4)和B'/C(3) 13种亚型,其比例分别为1.22％、1.22％、3.66％、28.05％、9.76％、2.44％、1.22％、21.95％、3.66％、1.22％、17.07％、4.88％和3.66％,B'、CRF01_AE和CRF07 BC为主要亚型,6种少见亚型(A1、A2、G、H、CRF02_AG和CRF06_cpx)合计占11.0％.结论 北京地区女性HIV-1感染者流行毒株遗传多样性高于男性,B'亚型比例高,少见亚型比例也较高.
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北京市2006年HIV-1流行毒株的gag和env基因序列测定及亚型分析
目的 监测2006年北京市北京户籍HIV感染者中HIV-1型流行病毒株的亚型分布特点和变化规律.方法 采集北京市2006年新确认北京户籍HIV-1感染者的抗凝全血样品32份,分离血浆,提取病毒RNA,用巢式聚合酶链反应方法扩增病毒gag和env基因,并进行序列测定和亚型分析.结果 系统进化分析表明北京户籍HIV-1感染者样品分别属于5个亚型,分别为B亚型9份,泰国B亚型2份、C亚型2份,流行重组型CRF07 BC亚型5份,流行重组型CRF01 AE亚型4份.结论 北京市居民中已存在多种HIV-1亚型和流行重组型,应加强对HIV-1毒株亚型变异的监测,及时调整防治策略.
关键词： 人类免疫缺陷病毒1型 亚型 巢式聚合酶链反应 -
中国北方5城市慢性乙型肝炎患者中SEN病毒检测
目的了解SEN病毒D和H(SENV-D/H)在中国慢性乙型肝炎患者(CHB)中的感染情况.方法应用巢式聚合酶链反应法(nPCR),对中国北方5城市595例CHB患者和北京市96名正常人血清检测SENV-D/H DNA,并用PCR产物直接测序法对7株SENV进行了序列分析.结果CHB患者SENV感染率为61.3%,正常人为62.5%,两者差异无显著性(χ2=0.047,P=0.829).但不同城市CHB患者中SENV感染率存在一定差异.从不同城市分离的SENV 的核苷酸序列同源性较高,4株SENV-D同源性为91%～98%,3株SENV-H同源性为95%～98%.结论在5城市CHB患者中存在SENV-D/H感染,其感染率与正常人群相似,提示SENV- D/H可能没有直接致病性.
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利用巢式聚合酶链反应检测单个胚胎小体细胞中时钟基因的表达
目的 建立一组灵敏的检测时钟基因(clock gene)的巢式聚合酶链反应(nested PCR)方法,并检测小鼠胚胎小体(EB)来源的单细胞中重要时钟基因的表达情况.方法 培养小鼠胚胎干细胞(mESC),体外诱导分化为EB,提取总RNA并进行反转录,用BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因特异引物进行巢式聚合酶链反应,电泳检测扩增产物,从而建立相应的巢式PCR反应体系.利用膜片钳获取胚胎小体来源的单个细胞,通过巢式PCR反应检测相应时钟基因的表达情况.结果 确定了BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因的扩增参数.证明在此条件下无非特异扩增,并且能够检测到至少两个拷贝的目的分子.利用此检测体系发现,部分胚胎小体细胞中BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2时钟基因环路不完整.结论 巢式PCR方法能够灵敏地、而且特异地从单细胞中检测出一组时钟基因的表达,时钟基因的转录在胚胎小体细胞中并不一致,即时钟基因的环路不完整.时钟基因可能在细胞分化过程中发挥着某种作用.
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Kikuchi淋巴结炎60例病理形态变化规律及鉴别诊断
目的 探讨Kikuchi淋巴结炎病理形态变化规律及与非霍奇金淋巴瘤(包括NK/T细胞淋巴瘤)、不典型分枝杆菌结核、猫抓病鉴别的诊断.方法 应用组织病理学、免疫组化、结核杆菌DNA、巢式聚合酶链反应(N-PCR)技术观察60例Kikuchi淋巴结炎活检标本的病理形态学特征.结果 Kikuchi淋巴结炎95%的病例同时可见增生(PT)、坏死(NT)及黄色瘤(XT)3型改变,其中PT为主占56%,NT占39%,XT占5%;受损区域可见到组织细胞、巨噬细胞、浆样单核细胞、免疫母细胞、小淋巴细胞5种类型细胞;组织细胞每例可见,常共同表达CD68、MAC387及髓过氧化物酶(MPO)3种抗原;PT期抗体Ki-67强(+),NT灶内细胞FAS(+);PCR检测发现10/60(16.7%)结核杆菌阳性,在10例阳性中仅有6例抗BCG(anti mycobacterium bovis)(+).结论 Kikuchi淋巴结炎病变特征复杂,以组织细胞为主体的多细胞组成,以凋亡坏死为主,存在PT→NT→XT病变发展规律;针对组织细胞进行免疫酶标及巨噬细胞结核杆菌DNA检测有助于诊断及鉴别诊断.
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巢式聚合酶链反应结合Real-time聚合酶链反应用于检测百日咳鲍特菌方法建立及应用
目的 建立一种具有高敏感性、高特异性的百日咳鲍特菌聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测方法.方法 以百日咳鲍特菌插入序列IS481为目的基因,通过Primer5.0软件设计巢式PCR(Nested PCR,nPCR)外引物,并优化扩增条件和程序,结合IS481目的基因的检测方法,建立nPCR结合Real-time PCR(rPCR)检测百日咳鲍特菌的方法,应用于354份流感样病例标本核酸检测和34份临床疑似百日咳病例标本核酸检测.结果 该结合检测方法的低检出限为0.225 copies/μL,能同时检测百日咳鲍特菌和霍氏鲍特菌,其他参考菌株均呈阴性,具有较好的特异性,进一步通过rPCR区分霍氏鲍特菌.采用该结合检测技术,354份流感样病例核酸标本中17份百日咳鲍特菌阳性,34份临床疑似百日咳病例核酸标本中12份百日咳鲍特菌阳性,而单独针对百日咳鲍特菌的rPCR方法分别仅检测出1份和6份阳性,rPCR检出的阳性标本,本方法均可检出.结论 基于IS481基因的nPCR结合rPCR方法可用于百日咳鲍特菌的检测,具有较高的敏感性和特异性特点.
关键词： 巢式聚合酶链反应 Real-time聚合酶链反应 百日咳 -
青海省互助、泽库和祁连县啮齿类动物伯氏疏螺旋体调查
目的：调查确定青海省3县啮齿类标本中伯氏疏螺旋体带菌情况。方法从青海省互助、泽库和祁连县共采集啮齿类动物202只，采用巢式PCR方法检测其伯氏疏螺旋体的带菌率。结果采用巢式PCR方法检测啮齿类动物标本202份，阳性49份，伯氏疏螺旋体平均阳性率为24.26%。其中互助县标本共67份，阳性12份，阳性率为17.91%；泽库县标本共78份，阳性27份，阳性率为34.62%；祁连县标本共57只，阳性10份，阳性率为17.54%。3个县的啮齿类动物伯氏疏螺旋体阳性率差异有统计学意义（χ2＝7.40，P＜0.05）。结论青海省互助、泽库和祁连县啮齿类动物中均存在伯氏疏螺旋体感染，应进一步对当地的媒介和人群进行调查，从而为当地莱姆病的防控提供参考。
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河南省首次实验室证实恙虫病暴发疫情
目的 调查以发热、头痛、淋巴结肿大、皮疹为主要症状的不明原因疾病病因.方法 对可疑病人进行流行病学调查,用血清学、巢式PCR方法检测病人血清抗体滴度、血清型及立克次体特异性基因片段.结果 对发生在农村的32例病人中的20例病人进行血清外裴OXK凝集反应,阳性率达100%,其中11份的第2次病人血清PXK反应呈4倍升高;间接免疫荧光法检测IgM和IgG抗体,20份均为阳性,高达N1:2560;恙虫病血清学分型Gilliam 4例,Karp 6例,Kato 8例.巢式PCR检测病人血凝块,结果3份扩增出Ot特异性DNA片段.结论 首次证实河南省出现恙虫病暴发疫情.
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浙江省在鼠类中检测到伯氏疏螺旋体ospA基因
目的 了解浙江省磐安县鼠中感染伯氏疏螺旋体的情况,研究以外膜蛋白A(OspA)为靶基因的PCR方法在浙江省的应用.方法 利用PCR方法,检测磐安县128份鼠肝、脾标本中ospA基因特异片段；对所检测到的阳性结果进行序列测定,并进行分析.结果 从128份鼠肝、脾标本中检测发现4例ospA基因阳性片段,其中3份来自黄毛鼠,1份来自大林姬鼠；核酸序列基本一致,与伯氏疏螺旋体法雷斯疏螺旋体高度相似.结论 利用ospA基因能从标本中检测到伯氏疏螺旋体；浙江省部分山区存在鼠感染伯氏疏螺旋体的情况,其中伯氏疏螺旋体法雷斯疏螺旋体占优势.
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巢式PCR及序列分析用于攀枝花市恙虫病东方体检测
目的 对采集自攀枝花市的疑似恙虫病患者血液样本进行实验室检测,了解攀枝花地区恙虫病东方体感染情况,同时为四川省恙虫病早期诊断提供依据.方法 运用巢式PCR对2013年7-10月采集自攀枝花市的48份疑似恙虫病患者全血样本中提取的基因组DNA进行恙虫病东方体sta-58编码基因检测;随机挑取2份阳性样本进行恙虫病东方体sta56基因片段扩增、测序及序列分析.结果 48份样本中,巢式PCR检测阳性的样本18份;2份样本均扩增到恙虫病东方体sta56基因片段,其序列同源性为96％,系统进化分析显示该2株恙虫病东方体均与某些恙虫病东方体台湾株位于同一个分支,同时与Karp株位于同一个分支.结论 在四川省范围内首次运用巢式PCR法检测恙虫病东方体,实验室确诊攀枝花市存在恙虫病的感染,攀枝花市部分恙虫病患者由恙虫病东方体Karp型感染,在遗传进化上与某些台湾恙虫病东方体株关系密切.
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首次实验室证实北京平谷地区恙虫病东方体暴发流行
目的 了解北京市平谷地区是否存在恙虫病东方体感染.方法 采用巢式聚合酶链反应(nPCR),对平谷地区采集的30份临床标本进行恙虫病东方体热休克蛋白(groEL)基因和56×103蛋白扩增并测序分析.采用间接免疫荧光试验(IFA)对血清标本恙虫病东方体特异抗体检测.结果 采用PCR共检测血液标本30份,均阳性(100%);用IFA检测28份患者血清抗体,25份阳性(89.3%);长片段PCR扩增,3份标本扩增阳性,阳性结果测序比对所有核苷酸序列相同,与Kawasaki的同源性为96%.结论 首次从分子流行病学和血清流行病学的角度证实北京平谷地区存在恙虫病东方体.
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3种实验室检测方法在疟疾诊断中的应用比较
目的：探讨3种实验室检测方法在疟疾诊断方面的应用价值。方法分别采用传统镜检法、OptiMAL法及巢式PCR法，对辽宁省2011－2013年的102份疟疾疑似病例血样进行检测。结果镜检法、OptiMAL法和PCR法阳性率分别为54.90%、63.73%和70.59%，三者两两比较，只有镜检法和PCR法差异有统计学意义（χ2＝4.718，P＝0.030）。3种方法中，PCR法的敏感性和特异性好。结论镜检法结合OptiMAL法和PCR法会提高疟疾病例的诊断水平。
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从单个细胞扩增靶基因片段的技术
目的建立从人的单个细胞扩增特定靶基因片段进行基因诊断的技术.方法利用显微操作技术挑取单个纤维母细胞,各置于0.2 ml簿壁反应管的裂解液中,合成针对抑癌基因P53第5～9外显子(e)的引物,运用15mer高度随机引物或一个特异引物进行单个细胞的整个基因组DNA或特异靶片段的预扩增,再以其为模板进行巢式聚合酶链反应(PCR)扩增P53基因第e5～9的1 900 bp片段及含第5,6外显子的580 bp片段.并用ABI-377测序仪测定其序列.结果运用稀释至0.01 ng的基因组DNA扩增1 900 bp片段,优化PCR的条件.分别从30个单个纤维母细胞扩增上述1 900 bp片段,10个获得1 900 bp片段,成功率为33%.扩增580 bp片段,则阳性率可达60%.序列分析证明确为人P53基因第5,6外显子序列.结论运用本实验室建立的技术可从人的单个细胞扩增特定靶基因片段,并测定其序列,作出基因诊断.
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多种指标检测造血干细胞移植术后人巨细胞病毒活动性感染研究
移植受体在造血干细胞移植术后超大剂量化疗和免疫抑制剂的应用,免疫系统功能大大低于正常人,潜伏的人巨细胞病毒(HCMV)病毒易重新激活而导致的严重感染,是影响造血干细胞移植术后受体生存率和生活质量的重要感染因素[1].本研究通过免疫组化法和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HCMV抗原、IgG/IgM抗体及巢式聚合酶链反应(nest-PCR)检测HCMV-DNA,研究其诊断价值.
