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应用全基因组扩增技术对α地中海贫血进行植入前遗传学诊断的效果分析
目的 研究α地中海贫血患者囊胚活检后先进行全基因组扩增后再应用荧光PCR进行诊断的效果. 方法 回顾分析本中心2015年1月至2016年11月α地中海贫血PGD周期资料,共139个周期,对比分析卵裂球活检后直接应用荧光PCR进行诊断(诊断方法一)与囊胚活检后先进行全基因组扩增后再应用荧光PCR进行诊断(诊断方法二)的结果. 结果 两组在女方年龄、获卵数、正常受精数均无统计学差异(P＞0.05),但方法二(7.61±3.05)的平均活检个数显著小于方法-(9.48±3.66) (P＜0.05).两种方法的正常胚胎率(35.22％ vs.25.87％)、杂合子胚胎率(30.11％ vs.50.19％)、异常胚胎率(30.11％ vs.23.94％)、诊断失败率(16.21％ vs.2.81％)有统计学差异(P＜0.05),临床妊娠率(50.00％ vs.52.17％)无统计学差异(P＞0.05). 结论 囊胚活检后先进行全基因组扩增后再应用荧光PCR进行诊断的效果明显好于卵裂球活检后直接应用荧光PCR进行诊断.
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在β地中海贫血着床前遗传学诊断中应用多重置换扩增进行预处理的临床分析
目的 分析应用多重置换扩增技术(multiple displacement amplification,MDA)进行全基因组扩增的预处理是否影响β地中海贫血着床前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)的准确效能. 方法 回顾性地分析2009年1月至2013年6月,因双方均为β地中海贫血携带者而行PGD治疗的周期资料,其中34个周期采用多重巢式聚合酶链反应(PCR)结合反向斑点杂交技术对单细胞进行诊断,另有38个周期行MDA进行全基因组扩增的预处理后,再结合反向斑点杂交技术进行诊断. 结果 两组患者在年龄、获卵数等实验室指标上无统计学差异.MDA组未检出(扩增失败)率为9.79％,低于行巢式PCR组的15.24％,而杂合子率46.33％则略高,但两种方法在诊断结果上并无统计学差异. 结论 应用MDA技术进行全基因组的预扩增可有效增加检测模板,实现多位点及多种疾病的诊断,而且不影响β地中海贫血地贫基因的诊断效能.
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基于新一代测序的SNP单体型分析在先天性挛缩性蜘蛛样指症PGD中的应用
目的 探讨基于新一代测序(NGS)的单核苷酸多态性(SNP)单体型分析在先天性挛缩性蜘蛛样指症(CCA)种植前遗传学诊断中的有效性. 方法 对活检的滋养层细胞采用多重置换扩增(MDA)的方法扩增全基因组,应用基于NGS的SNP单体型分析和直接测序两种方法对MDA产物进行CCA的种植前遗传学诊断(PGD). 结果 应用MDA方法对活检的4枚囊胚的滋养层细胞成功地进行了全基因组扩增;通过基于NGS的SNP单体型分析发现,其中两枚是未感染CCA的囊胚,另两枚是感染CCA的囊胚;单体型分析结果与直接测序法结果一致.取卵5个月后患者移植一枚基因型正常的冷冻囊胚,于妊娠的第38周经剖宫产成功分娩一体重为2 850 9的健康婴儿. 结论 基于NGS的SNP单体型分析是单基因病的种植前遗传学诊断的有效筛查工具.
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微阵列比较基因组杂交技术用于植入前胚胎非整倍体筛查的初步观察
目的:探讨微阵列比较基因组杂交(aCGH)技术在植入前胚胎非整倍体筛查中的应用.方法:选取就诊于天津医科大学总医院生殖中心行体外受精-胚胎移植患者冻存的正常8细胞胚胎4枚,患者夫妇均自愿捐献冻存胚胎用于科研并签订知情同意书.分别从4枚冻融胚胎中获取卵裂球进行多重置换扩增,扩增产物经过酶切、荧光标记、纯化、定量后与处理后的正常女性单个淋巴细胞扩增产物共同杂交(采用aCGH芯片),利用Agilent扫描仪扫描芯片、获取图像并通过软件读取和分析数据,将重复/缺失区域在染色体上定位.结果:胚胎1的1～4号样本中1号样本的aCGH结果为47,XX,del(5)(p15.33-p12),del(9)(q13-q34.13),+21;2～4号样本均为46,XX.胚胎2的5、6号样本结果均为47,XX,+19.胚胎3的7、8号样本结果均为46,XX.胚胎4的9、10号样本结果均为46,XY.结论:aCGH能够用于检测植入前胚胎单个卵裂球细胞全基因组的非整倍体筛查.
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基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法研究
为了便于新发或罕见病毒性传染病的筛查检测,本研究利用多重置换扩增技术,以负链RNA病毒一发热伴血小板减少综合征病毒和正链RNA病毒一登革病毒为模拟样本探索临床样本中RNA病毒基因组非特异性扩增方法.研究中通过梯度稀释的RNA病毒模拟样本中可能存在的不同丰度的病原体,样本核酸依次加工成单链cDNA、双链cDNA、T4 DNA连接酶处理后的双链cDNA以及添加外源辅助RNA后合成并连接的双链cDNA形式,然后进行Phi29 DNA聚合酶等温扩增,使用荧光定量PCR方法比较各种方法对RNA病毒核酸扩增的影响.结果显示,对于不同类型的RNA病毒模拟标本,多重置换扩增对于单链及双链cDNA的扩增效果有限,而双链cDNA经DNA连接酶处理后的扩增能达到6×103倍；在cDNA合成过程中加入外源辅助RNA,模拟样本中病毒基因组的扩增可达2×105倍,尤其是对含有低丰度病原体的模拟样本扩增效果的改善更为明显.本研究摸索建立了基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法,能够对样本中低丰度RNA病毒基因组实现有效扩增,可满足开展多种病原体筛查检测的需求.
关键词： 多重置换扩增 Phi29 DNA聚合酶 RNA病毒 -
MDA-MSP技术检测粪便miR34b/c甲基化及其在结直肠癌早期诊断中的意义
目的:探讨粪便miR34b/c甲基化状态的检测在结直肠癌早期诊断中的意义.方法:从126例结直肠癌患者癌组织、癌旁组织、粪便和64例正常对照者的粪便中分别提取DNA,采用多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)技术对经过亚硫酸氢盐修饰样本进行全基因组扩增,结合甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测组织和粪便中miR34b/c基因甲基化状态.结果:结直肠癌癌组织miR34b/c基因的甲基化阳性率为95.2％(120/126),对应的癌旁正常组织为11.9％(15/126),两者比较有显著差异(P＜0.01); miR34b/c甲基化状态与各临床病理参数无显著相关(P＞0.05).结直肠癌粪便miR34b/c甲基化阳性率为90.2％(111/123),显著高于正常对照7.8％(5/64),差异有统计学意义(P＜0.01).粪便DNA miR34b/c用于结直肠癌早期诊断的敏感性为91.2％,特异性为92.2％.结论:miR34b/c甲基化是结直肠癌的重要分子特征,检测粪便miR34b/c甲基化有望成为结直肠癌早期诊断的一个全新的肿瘤标志物.MDA结合MSP为miRNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段.
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多重置换扩增技术在植入前遗传学诊断中的应用
多重置换扩增技术(MDA)是基于环状滚动扩增的全基因组扩增技术,具有高扩增效率和高保真性等特点.尽管用于单细胞扩增时存在某些缺陷,但其在胚胎植入前遗传学诊断(PGD)实验研究和临床应用中仍取得巨大进展.MDA联合常规PCR技术已成功用于PGD的临床诊断,实现了单次胚胎活检、单个胚胎细胞的性别、部分单基因病的同步诊断.
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X-连锁慢性肉芽肿病的植入前遗传学诊断方法学研究
目的:采用多重置换扩增(MDA)建立一种可靠、准确的植入前遗传学诊断(PGD)方法,可应用于X-连锁慢性肉芽肿病的PGD.方法:采用16个位于CYBB基因两侧的短串联重复序列(STR)位点对X-连锁慢性肉芽肿病家系进行单体型分析,采用MDA对单细胞进行全基因组扩增,对其产物采用在家系分析中具有多态性的STR位点及特异性扩增CYBB基因进行分析,同时采用位点Amel进行性别诊断.结果:家系分析结果显示共有7个STR位点具有多态性.共进行了10个单淋巴细胞及10个单卵裂球的MDA,全部扩增成功.对致病基因CYBB外显子8的聚合酶链反应(PCR)扩增效率为100％,其中1个单淋巴细胞发生致病位点的等位基因脱扣(ADO),10个单卵裂球诊断结果均为215 bp,未检测出异常的204 bp条带,ADO率为10％(1/10);对于7个有多态性的STR位点和位点Amel,PCR扩增效率为96.9％(155/160),ADO率为11.3％(13/115).结论:采用MDA结合致病基因特异性扩增及单体型分析在单细胞水平对X-连锁慢性肉芽肿病进行检测,两者相结合可避免污染、ADO等导致的误诊,可提高PGD的诊断效率,为进一步的临床应用奠定了基础.
关键词： X-连锁慢性肉芽肿病 系谱 植入前诊断 多重置换扩增 单体型分析 -
全基因组扩增技术在植入前遗传学诊断中的应用
全基因组扩增技术是一种对微量DNA进行均衡扩增的方法,用于各类遗传检测,对于获取细胞数目及DNA量非常有限的植入前遗传学诊断是十分可贵的.该项技术主要包括经热循环扩增和恒温扩增两类方法,其中恒温扩增的多重置换扩增法为近几年发展起来的技术,目前多重置换扩增法在植入前遗传学诊断中的应用正备受关注.对全基因组扩增技术的常用方法,尤其对多重置换扩增法及其在植入前遗传学诊断中的应用现状做综述.
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植入前遗传学诊断新进展
植入前遗传学诊断是辅助生殖技术的一个重要方面,其发展日新月异.新方法、新技术不断出现并应用于临床植入前遗传学诊断中,如微阵列比较基因组杂交、微测序技术、多重置换扩增等.这些方法及两个或两个以上方法的综合应用大大增加了诊断的准确性,减小误诊风险.同时,也有一些关于植入前遗传学诊断的争议,如胚胎植入前遗传学筛查,以及对植入前遗传学诊断远期安全性的担忧.就该领域一些新方法及其原理和争议等进行综述.
关键词： 植入前遗传学诊断 比较基因组杂交 微测序技术 多重置换扩增 胚胎植入前遗传学筛查 -
Phi29DNA聚合酶新应用研究进展
phi29 DNA聚合酶来源于枯草芽孢杆菌噬菌体phi29,具有连续合成和链置换性质,且具有高保真性.它是DNA扩增包括滚环扩增和多重置换扩增的理想工具.文章从phi29 DNA聚合酶的来源和结构与功能、近期对于phi29 DNA聚合酶的应用研究人手,综述了phi29 DNA聚合酶的结构与功能的关系及其用于核酸测序,病毒检测,miRNA检测方面的应用前景.
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多重置换扩增在植入前胚胎性别诊断中的应用
目的 用多重置换扩增(MDA)方法,对植入前胚胎的单个卵裂球全基因组扩增后进行植入前胚胎性别的遗传学诊断.方法 用单细胞多重置换扩增方法对20个胚胎共20个单卵裂球进行全基因组扩增,用荧光PCR检测SRY、AMEL、XHPRT及X22 4个性别相关的基因座,检测胚胎性别,同时用同一胚胎另一卵裂球FISH结果作为对照.结果 20个卵裂球MDA均扩增成功,扩增成功率100％.20个胚胎均得到诊断,性别诊断成功率100％,其中12例为男性胚胎,8例为女性胚胎,与FISH结果一致率100％,诊断准确率100％.结论 可以用单卵裂球MDA后荧光PCR检测多个基因座的方法对胚胎性别进行快速、准确的植入前诊断.
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囊胚细胞WGA结合短片段Gap-PCR的α-地贫SEA突变快速植入前遗传学诊断
目的 建立一种基于囊胚细胞全基因组扩增(WGA)结合目的序列短片段Gap-PCR基因分型技术的α-地中海贫血东南亚型(SEA)缺失突变快速植入前遗传学诊断新方法.方法 以多重置换扩增(MDA)WGA技术为基础,建立以管家基因GAPDH和β-actin为目的序列的WGA产物双重荧光PCR质检体系,以及突变和正常序列短片段Gap-PCR的α-地中海贫血SEA缺失基因分型体系,通过对不同细胞数SEA携带者淋巴细胞样本的检测进行灵敏度与准确性评价,对12例囊胚活检样本的检测进行应用评价.结果 应用本研究建立的方法,不同淋巴细胞数样本的结果显示3细胞时即未出现等位基因脱扣,4细胞时目标模板的WGA产物量趋于稳定;10例WGA成功的囊胚活检样本的基因分型结果分别为--SEA/αα(5例)和αα/αα(5例),与验证基因型相符.结论 本研究建立的方法为一个完整检测流程,即以4～6个囊胚活检细胞为检材,对MDA产物进行WGA质检及相对浓度评估后,以短片段Gap-PCR体系而实现α-地贫SEA缺失的PGD快速基因分型;此方法简单快速、结果准确、检测成本低而适合临床常规应用.
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采用多重置换扩增进行软骨发育不全的植入前遗传学诊断
[目的]采用多重置换扩增建立一种可靠、准确的植入前遗传学诊断方法,可应用于软骨发育不全的植入前遗传学诊断.[方法]对软骨发育不全高危家系采用8个与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)基因紧密连锁的短串联重复序列(STR)进行软骨发育与不全(ACH)的单体型分析.采用多重置换扩增(MDA)对单细胞进行全基因组扩增,对其产物采用在家系分析中具有多态性的STR位点及PCR-限制性酶切法检测FGFR3基因进行分析.[结果]对家系分析中,共有5个STR位点具有多态性.共进行了10个单淋巴细胞及11个单卵裂球的MDA,MDA扩增效率为100％(21/21),单个淋巴细胞MDA产物的PCR结果与其外周血结果比较,平均PCR扩增率为96.8％(122/126,变化范围95.4％～100％),平均ADO率为8.5％(7/82,变化范围0～12.6％),综合诊断效率为100％,其中一个单淋巴细胞的MDA产物在经过酶切后未能检测出两个条带,出现了异常等位基因的脱扣,在11个单卵裂球的MDA产物中进行致病基因的检测,经酶切后均只产生一条条带.[结论]本研究采用限制性酶切法直接检测FGFR3基因及单体型分析在单细胞水平对ACH进行检测,两者相结合可避免污染、等位基因脱扣等导致的误诊,可提高软骨发育不全的PGD诊断效率,为进一步的临床应用奠定了基础.
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SNP基因芯片结合多重置换扩增技术检测单细胞非整倍体的研究
[目的] 建立并优化利用微阵列-比较基因组杂交技术检测单细胞非整倍体的实验方案. [方法] 纤维母细胞系GM02732(47,XY,+18)和GM00343[46,XY,4(del) (qter ＞ p14)]被用于实验.阳性对照组为上述细胞系的基因组DNA(gDNA)(A组与B组,n ＝ 6);实验组为单细胞模板的多重置换扩增(MDA)产物(C组与D组,n ＝ 10);阴性对照组为空白对照的MDA产物(E组,n ＝ 6).以上样本与10 k 2.0基因分型芯片杂交并进行染色体拷贝数分析,比较利用非扩增的正常gDNA和同法扩增的DNA(MDA-DNA)作为分析参照对C组和D组的结果准确度的影响.[结果] A→E组的芯片杂交信号判读率分别为98.7%、97.2%、86.7%、85.9%与3.2%.利用单细胞MDA-DNA作为参照时,C组与D组杂交信号的变异程度明显小于使用gDNA作为参照时(P ＜ 0.05).利用CNAT分析软件,发现以gDNA作为参照时,C组与D组部分染色体优势扩增明显,而使用MDA-DNA作为参照时则未观察到类似现象. [结论] 结合MDA和基因芯片平台对单细胞进行非整倍体检测时应使用同法扩增的DNA作为分析参照.
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X-连锁严重联合免疫缺陷病的植入前遗传学诊断
[目的]采用多重置换扩增建立一种可靠、准确的植入前遗传学诊断方法,应用于X-连锁严重联合免疫缺陷病(X-SCID)的植入前遗传学诊断(PGD).[方法]选择5个位于致病基因IL-2受体γ链(IL2RG)基因两侧的短串联重复序列(STR)位点对X-SCID家系进行单体型分析,采用多重置换扩增(MDA)对单细胞进行全基因组扩增,对扩增产物采用在家系分析中具有多态性的STR位点进行单体型分析,结合位点Amel进行性别诊断,STR位点均采用单重荧光PCR,同时对IL2RG基因exon5进行测序分析.[结果]对家系分析中,共有3个STR位点具有多态性.对10个单淋巴细胞及10个单卵裂球进行了预实验:MDA扩增成功率为100%,对致病基因IL2RG exon5的行基因测序的检测效率为100%;对于3个有多态性的STR位点和AMEL,PCR扩增效率为96.3%(77/80),等位基因脱扣率(ADO)为11.5%(7/61).对该家系进行了一个周期的PGD,对7个胚胎进行了诊断,其中2个为正常胚胎,移植后获得双胎妊娠,早产活产一个健康男婴及一个健康女婴.[结论]采用多重置换扩增结合致病基因特异性扩增测序检测及单体型分析在单细胞水平对X-连锁严重联合免疫缺陷病进行检测,两者相结合可避免污染、等位基因脱扣等导致的误诊,提高了PGD诊断效率.
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多重置换扩增在地中海贫血植入前遗传学诊断中的应用
多重置换扩增（ MDA）技术作为一种全新的全基因组扩增技术，为单细胞的后续检测提供了足够和稳定的DNA，在地中海贫血植入前遗传学诊断的实验研究和临床应用中取得了较大进展。该文就MDA的原理、技术特点及其在地中海贫血植入前遗传学诊断中的应用研究进展进行综述。
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Keihuaer抗酸染色标记FNRBC结合多重置换扩增行产前基因诊断的初步研究
目的 探讨Keihuaer抗酸染色法标记孕妇外周血中胎儿有核红细胞(fetal nucleated red blood cell , FNRBC),并结合单细胞聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术行产前性别相关基因诊断的可行性. 方法 采集12例孕周为10周～16周的孕妇外周血10ml,经Percoll不连续密度梯度离心初步分离后,运用Keihuaer抗酸染色法对FNRBC进行特殊染色标记,显微操作法获取阳性单个靶细胞,经过多重置换扩增,全基因组扩增产物作为PCR模板,行STS (steroid sufatase)基因同源序列PCR性别诊断,以验证靶细胞的胎源性.结果 12例孕妇外周血中FNRBC阳性标记11例,1例未获取FNRBC;对获取的4个FNRBC单细胞进行性别初步诊断,其中2例证实为男胎,2例为女胎,经证实均与临床诊断相符合,准确率为100%.结论用Keihuaer抗酸染色标记及显微操作法获取的FNRBC,经多重置换扩增后可用于无创性产前基因诊断,实验操作可行、诊断准确,具有重要临床应用价值.
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基于多重置换扩增及测序技术的胚胎植入前HLA分型方法
目的 建立基于多重置换扩增及测序技术的胚胎植入前HLA分型方法.方法 随机选取9对自愿捐献外周血和废弃胚胎的夫妇,取D3废弃的1PN、2PN、3PN受精胚胎,取单个或两个卵裂球细胞,采用多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)进行全基因组扩增,对单个或两个卵裂球的MDA产物采用PCR扩增HLA-DR、DQ第2外显子,然后对扩增产物进行直接双向测序分型(sequencing based typing,SBT),确定胚胎HLA基因型;提取其父母外周血基因组DNA,采用同样的方法确定其HLA基因型;然后比较父母与胚胎之间HLA基因型,确定9个家庭成员各自的HLA单倍型及其遗传关系,并在废弃胚胎之间进行HLA配型.结果 76个废弃胚胎被分为两组:单卵裂球组36个胚胎,两个卵裂球组40个胚胎.单卵裂球组扩增成功率为94.1％;两个卵裂球组扩增成功率为100％.共有74个胚胎MDA扩增成功.其产物行PCR-SBT检测,阳性率为100％.单卵裂球组MDA产物测序阳性率为100％,DQ等位基因脱扣率为1.5％,DR等位基因脱扣率为0.两个卵裂球组MDA产物测序阳性率为100％,DQ、DR等位基因脱扣率均为0.胚胎HLA单倍体重新组合率为20.2％(30/148).废弃胚胎之间HLA配型一致的比例为20.3％(15/74).比理论值25％略低,可能与本实验使用分级差、异常受精胚胎有关.结论 植入前遗传学诊断/HLA分型方法MDA-PCR-SBT为选择与患儿HLA基因型一致且正常的纯合子(不携带致病基因)或者杂合子(携带隐性致病基因)胚胎移植,创造一个救助者同胞,分娩时使用救助者同胞的脐血或者骨髓移植用于治疗现存患儿提供了新的检测方法.
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少量细胞模板下多重置换扩增技术的保真度评估
目的 应用单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片,检测以少量细胞(1～10个)为模板的多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)产物的保真度.方法 结合10K 2.0 SNP芯片平台与MDA,以纤维母细胞系GM02732(47,XY,+18)作为模板,共分6组进行实验,其中A组与B组分别为阳性对照组(细胞gDNA)与阴性对照组(无模板MDA);C～F组为实验组,分别以1、2、5和10个细胞为模板进行MDA扩增,产物与芯片杂交,检测并比较各组产物的基因组覆盖率、等位基因杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)率以及等位基因脱扣(allele dropout,ADO)率.结果 阴性对照组的MDA产物与gDNA序列有3.2%的重叠.随着起始模板从单细胞提升至10细胞,MDA产物的基因组覆盖率从86.4%逐步上升至96.4%,平均LOH率和ADO率则逐渐下降,各组之间比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 多重置换扩增技术是一种高效而可靠的全基因组扩增方法 ,随着模板细胞的增加,MDA产物的保真度可获得明显的改善.10K 2.0 SNP芯片可快速准确地在全基因组水平对DNA扩增产物进行保真度分析,但应注意区分LOH中的ADO和等位基因优势扩增,以避免产生误差.
