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长距离等位特异性PCR法直接分析T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因-574和-4529位点分子单体型
单体型为位于1条染色体上或某一区域的一组相关联单核苷酸多态性(SNPs)等位位点的集合.它在基因作图研究中,特别是复杂性疾病相关研究中比单个SNP可提供更多的信息[1-3].常规基因分型工具不能在1个二倍体细胞提供单体型信息,因此,单体型分析已经成为疾病相关性研究中的一个普通工具[4].
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X-连锁脊柱骨骺发育不良家系孕早期产前诊断一例
2007年本实验室对1例X-连锁脊柱骨骺发育不良家系(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,X-SEDL)进行基因诊断[1],确诊该家系的先证者(图1:I:1)为位于染色体Xp22.2的SEDL基因的4号外显子c.209G＞A突变致病,其女儿(图1:Ⅱ:1)为该致病基因突变携带者(c.209G/A杂合突变).2008年,该女性携带者于妊娠19周时曾在本院对胎儿(图1:Ⅲ:1)采集的羊水细胞进行基因诊断,证实为男性胎儿伴遗传突变基因而引产.此次妊娠11周时要求在孕早期对胎儿(图1:Ⅲ:2)进行产前诊断.签署手术知情同意书后,行绒毛膜穿刺术取绒毛组织.部分绒毛组织标本经常规细胞培养、收获制片后G显带染色体核型分析.部分绒毛组织提取基因组DNA,进行Y染色体性别决定基因(sex determining region of Y chromosome,SRY)检测,判断性别,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)条件参照文献[2].参照相关研究[1]直接PCR扩增SEDL基因4号外显子,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、回收纯化后进行DNA序列分析.同时选择Xp22区域内位于SEDL基因附近的4个短串联重复(shorttandemrepeat,STR)位点(包括DXYS10085、DXYS10092、DXYS10093和DXYS233)进行PCR扩增检测,PCR扩增引物及反应条件见参考文献[3],进行单体型分析.
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一个中国汉族痣样基底细胞癌综合征家系致病基因的定位研究
目的定位一个中国汉族痣样基底细胞癌综合征(NBCCS)家系的致病基因.方法选择SHH信号系统的基因作为该NBCCS家系致病基因的候选基因,用微卫星遗传标记在候选基因染色体区域定位致病基因.结果连锁分析结果发现,PTCH2基因所在染色体区域微卫星遗传标记D1 s2797 LODZMAX为1.31(平均遗传距离73.81)、D1 s2802 LODZMAX为1.26(平均遗传距离73.81),支持连锁.构建单体型发现家系内所有病变表型的个体D1s2797和D1 s2802的基因型一致,无交换重组现象.而SHH,PTCH,SMO基因染色体区域微卫星遗传标记连锁分析结果不支持连锁.结论这个中国汉族NBCCS家系的致病基因定位在PTCH2基因染色体区域1p32.3,遗传距离为1.85cM.
关键词： 痣样基底细胞癌综合征 连锁分析 单体型分析 -
X-连锁慢性肉芽肿病的植入前遗传学诊断方法学研究
目的:采用多重置换扩增(MDA)建立一种可靠、准确的植入前遗传学诊断(PGD)方法,可应用于X-连锁慢性肉芽肿病的PGD.方法:采用16个位于CYBB基因两侧的短串联重复序列(STR)位点对X-连锁慢性肉芽肿病家系进行单体型分析,采用MDA对单细胞进行全基因组扩增,对其产物采用在家系分析中具有多态性的STR位点及特异性扩增CYBB基因进行分析,同时采用位点Amel进行性别诊断.结果:家系分析结果显示共有7个STR位点具有多态性.共进行了10个单淋巴细胞及10个单卵裂球的MDA,全部扩增成功.对致病基因CYBB外显子8的聚合酶链反应(PCR)扩增效率为100％,其中1个单淋巴细胞发生致病位点的等位基因脱扣(ADO),10个单卵裂球诊断结果均为215 bp,未检测出异常的204 bp条带,ADO率为10％(1/10);对于7个有多态性的STR位点和位点Amel,PCR扩增效率为96.9％(155/160),ADO率为11.3％(13/115).结论:采用MDA结合致病基因特异性扩增及单体型分析在单细胞水平对X-连锁慢性肉芽肿病进行检测,两者相结合可避免污染、ADO等导致的误诊,可提高PGD的诊断效率,为进一步的临床应用奠定了基础.
关键词： X-连锁慢性肉芽肿病 系谱 植入前诊断 多重置换扩增 单体型分析 -
TGF-β1基因多态性与广东地区子痫前期相关性研究
目的：：探讨转化生长因子β1( TGF-β1)基因4个位点-800 G/A、-509 C/T、+869 T/C、+915 G/C的单核苷酸多态性( SNP )及其构成的单体型与子痫前期( PE )的相关性。方法：随机选取2015年1月至12月于广州医科大学附属第三医院住院的广东地区汉族孕妇176例,其中PE患者88例( PE组)、正常妊娠88例(对照组)。利用SNaPshot技术对TGF-β1基因4个位点进行基因分型检测,分析PE 组与对照组的TGF-β14个SNP基因型分布及等位基因频率的差异,并对+869 T/C、-509 C/T两个位点构建单体型分析。结果：(1)中国广东地区汉族妇女中存在TGF-β1+869T/C、-509C/T多态性,暂未发现-800G/A、+915G/C多态性。(2)PE组+869T/C位点CC基因型、C等位基因频率明显高于对照组(44.32% vs 27.27%, P=0.028, OR=1.935,95%CI 为1.028~3.639；68.18% vs 56.25%,P=0.014,OR=1.667,95%CI为1.079~2.575),TT基因型和T等位基因则明显下降(5.68% vs 14.77%,P=0.040,OR=0.348,95%CI为0.118~1.021；31.82% vs 43.75%,P=0.014,OR=0.600,95%CI为0.388~0.927)；两组CT基因型分布无明显差异(52.27% vs 57.95%,P=0.272)。(3) PE 与对照组比较,-509C/T位点CC、CT、TT基因型分布无明显差异(14.77% vs 23.86%,P=0.090；47.73% vs 50.00%, P=0.440；37.50% vs 26.14%,P=0.072),而C等位基因明显下降(38.64% vs 48.86%, P=0.034, OR=0.659,95%CI 为0.431~1.006), T 等位基因明显升高(61.36% vs 51.14%,P=0.034,OR=1.518,95%CI 为0.994~2.318)。(4)单体型分析发现,由+869T/C、-509C/T两个位点构建的C-T单体型在PE组明显增加(62.79% vs 49.43%,P=0.008, OR=1.727,95%CI 为1.125~2.651),而 T-C 单体型明显下降(31.40% vs 42.33%,P=0.021,OR=0.618,95%CI 为0.398~0.961)。结论：(1) TGF-β1基因+869 T/C、-509 C/T SNPs可能与中国广东地区汉族妇女PE发生有关,而暂未发现-800 G/A、+915 G/C多态性。(2) TGF-β1基因SNP+869 T/CCC 基因型、C 等位基因,-509 C/TT等位基因可能是广东汉族妇女 PE 的危险因素,而+869 T/CTT 基因型、T 等位基因,-509C/TC等位基因可能是保护因素。(3)2个多态位点构成的C-T单体型可能是中国广东地区汉族妇女PE的危险因素,T-C单体型则是保护因素。
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采用多重置换扩增进行软骨发育不全的植入前遗传学诊断
[目的]采用多重置换扩增建立一种可靠、准确的植入前遗传学诊断方法,可应用于软骨发育不全的植入前遗传学诊断.[方法]对软骨发育不全高危家系采用8个与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)基因紧密连锁的短串联重复序列(STR)进行软骨发育与不全(ACH)的单体型分析.采用多重置换扩增(MDA)对单细胞进行全基因组扩增,对其产物采用在家系分析中具有多态性的STR位点及PCR-限制性酶切法检测FGFR3基因进行分析.[结果]对家系分析中,共有5个STR位点具有多态性.共进行了10个单淋巴细胞及11个单卵裂球的MDA,MDA扩增效率为100％(21/21),单个淋巴细胞MDA产物的PCR结果与其外周血结果比较,平均PCR扩增率为96.8％(122/126,变化范围95.4％～100％),平均ADO率为8.5％(7/82,变化范围0～12.6％),综合诊断效率为100％,其中一个单淋巴细胞的MDA产物在经过酶切后未能检测出两个条带,出现了异常等位基因的脱扣,在11个单卵裂球的MDA产物中进行致病基因的检测,经酶切后均只产生一条条带.[结论]本研究采用限制性酶切法直接检测FGFR3基因及单体型分析在单细胞水平对ACH进行检测,两者相结合可避免污染、等位基因脱扣等导致的误诊,可提高软骨发育不全的PGD诊断效率,为进一步的临床应用奠定了基础.
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X-连锁严重联合免疫缺陷病的植入前遗传学诊断
[目的]采用多重置换扩增建立一种可靠、准确的植入前遗传学诊断方法,应用于X-连锁严重联合免疫缺陷病(X-SCID)的植入前遗传学诊断(PGD).[方法]选择5个位于致病基因IL-2受体γ链(IL2RG)基因两侧的短串联重复序列(STR)位点对X-SCID家系进行单体型分析,采用多重置换扩增(MDA)对单细胞进行全基因组扩增,对扩增产物采用在家系分析中具有多态性的STR位点进行单体型分析,结合位点Amel进行性别诊断,STR位点均采用单重荧光PCR,同时对IL2RG基因exon5进行测序分析.[结果]对家系分析中,共有3个STR位点具有多态性.对10个单淋巴细胞及10个单卵裂球进行了预实验:MDA扩增成功率为100%,对致病基因IL2RG exon5的行基因测序的检测效率为100%;对于3个有多态性的STR位点和AMEL,PCR扩增效率为96.3%(77/80),等位基因脱扣率(ADO)为11.5%(7/61).对该家系进行了一个周期的PGD,对7个胚胎进行了诊断,其中2个为正常胚胎,移植后获得双胎妊娠,早产活产一个健康男婴及一个健康女婴.[结论]采用多重置换扩增结合致病基因特异性扩增测序检测及单体型分析在单细胞水平对X-连锁严重联合免疫缺陷病进行检测,两者相结合可避免污染、等位基因脱扣等导致的误诊,提高了PGD诊断效率.
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单体型分析:复杂疾病基因定位的新希望
对复杂疾病如2型糖尿病、精神分裂症和原发性高血压进行基因定位是后基因组学的主要挑战之一.单核苷酸多态(single nucleotide polymerphisms, SNPs)作为遗传标记(SNP少见等位基因频率＞0.1在基因组内大约每600 Kb出现一次)[1],因为其在人类基因内分布更为广泛和密集、低突变率和更加便于高通量检测,因而在关联研究较微卫星(Microsatellite)应用更加广泛.
