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生物钟基因:中药作用的新靶点
中医学早在两千多年前就已经提出了“择时给药”和“因时制宜”的理念.这一理念与现代的时间药理学、时间毒理学、时间治疗学不谋而合.现代时辰药理学研究发现生物钟不仅影响药物的吸收、分布、代谢和排泄,而且还与药物的治疗作用和毒性密切相关.生物钟是生物适应环境周期性变化的一种内在机制,存在于中枢和外周组织以及细胞中.生物钟系统由核心基因(Clock、Bmall和Npas2)、负反馈基因(Cry和Per)、钟控基因和靶基因(Dbp、Rev-Erbα、Rorα、Csnk、Temless等)组成.有研究显示,在分子生物学水平上,中药和中药复方可通过影响生物钟基因发挥治疗作用,因此,中药与生物钟之间存存相关性.文章对此做一综述,以期为中药作用的多靶点提供新思路.
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小鼠外周组织时钟基因启动子区甲基化分析
目的 应用一种简单快速经济的方法检测8个主要时钟基因PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、NPAS2、BMAL1和BMAL2启动子区甲基化状态,检测小鼠外周组织肝、心、肾、胸腺、睾丸时钟基因启动子区甲基化状态.方法 用偏重亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行修饰.修饰后的DNA为模板,两套不同的引物对:甲基化特异性引物对和非甲基化特异性引物对扩增小鼠肝、心、肾、胸腺、睾丸组织时钟基因启动子区.PCR产物进行电泳和测序.结果 扩增产物与预期片段大小相符合.PCR产物经过直接测序进一步证实小鼠外周组织时钟基因启动子区均为非甲基化状态.结论 建立了一种检测小鼠时钟基因启动子区甲基化的新方法,借此证明成年小鼠5个外周组织8个时钟基因启动子区均呈非甲基化状态.
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利用巢式聚合酶链反应检测单个胚胎小体细胞中时钟基因的表达
目的 建立一组灵敏的检测时钟基因(clock gene)的巢式聚合酶链反应(nested PCR)方法,并检测小鼠胚胎小体(EB)来源的单细胞中重要时钟基因的表达情况.方法 培养小鼠胚胎干细胞(mESC),体外诱导分化为EB,提取总RNA并进行反转录,用BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因特异引物进行巢式聚合酶链反应,电泳检测扩增产物,从而建立相应的巢式PCR反应体系.利用膜片钳获取胚胎小体来源的单个细胞,通过巢式PCR反应检测相应时钟基因的表达情况.结果 确定了BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因的扩增参数.证明在此条件下无非特异扩增,并且能够检测到至少两个拷贝的目的分子.利用此检测体系发现,部分胚胎小体细胞中BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2时钟基因环路不完整.结论 巢式PCR方法能够灵敏地、而且特异地从单细胞中检测出一组时钟基因的表达,时钟基因的转录在胚胎小体细胞中并不一致,即时钟基因的环路不完整.时钟基因可能在细胞分化过程中发挥着某种作用.
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C57小鼠肝、肾、脾、胸腺组织时钟基因的表达特点
目的 探测不同脏器组织中时钟基因的表达水平及其波动性.方法 用实时荧光定量PCR方法检测C57小鼠肝、肾、脾和胸腺中4种重要时钟基因mBMAL1、mPER1、mCRTY1和mCRY2的表达.结果 肝和肾中4种时钟基因的表达水平均有显著波动(P＜0.01);而脾中仅mBMAL1、mPER1、mCRY1的节律性表达明显(P＜0.01,P＜0.001,P＜0.05),并且波动振幅较为平和;胸腺中4种时钟基因的表达均不具备昼夜波动的特征,同时表达水平也与其他3种组织存在显著差异(P＜0.01).时钟基因所构成的环路在不同组织中也不尽相同,mPER1的负反馈效应在肝中较为主要,mCRY1和mCRY2的负反馈效应在肾和脾中较为主要.结论 不同周围组织的分子时钟存在着显著的差异,其相关正负反馈元件和环路有待进一步研究阐明.
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时钟基因启动子甲基化频率随增龄的组织特异性改变
目的：探索时钟基因启动子甲基化频率增龄性改变及其在衰老中的作用。方法4月龄(青年组，n=9)、20月龄(老年组，n=10) C57BL小鼠，采用甲基化特异性聚合酶链反应方法检测小鼠胃、脾、血管、肾、纹状体中时钟基因Per1/2、Bmal1/2、Cry1/2、Clock、Npas2启动子甲基化水平。结果老年组脾组织Cry1、Bmal2和NPas2启动子区甲基化频率高于青年组(P<0.05)，胃组织Per1基因启动子甲基化频率低于青年组(P<0.05)，血管组织Bmal1启动子区甲基化频率高于青年组(P<0.05)。结论多种时钟基因启动子甲基化可能参与衰老进程，并具有组织特异性。
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RNAi干扰大鼠VSMCs钟基因Per2对Dbp及AT1受体基因表达的影响
目的 应用RNAi技术干扰大鼠A7r5血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs) Per2基因并检测VSMCs时钟基因Bmall、输出基因Dbp及AT1受体基因(AGTR1) mRNA表达的变化,初步探讨时钟基因、输出基因及AGTR1间的相关性.方法 应用已筛选携带大鼠Per2基因干扰序列的慢病毒载体转染大鼠血管平滑肌A7r5细胞,通过RT-PCR方法检测时钟基因Per2及Bmall、钟控基因Dbp和AGTR1 mRNA水平及节律变化.结果 慢病毒载体转染A7r5细胞后,RT-PCR方法检测钟基因Per2的mRNA峰值时相后移,表达节律异常;钟基因Bmall的mRNA表达峰值增强,表达节律未受影响;下游输出基因Dbp的mRNA表达明显受抑,表达节律异常;AGTR1的mRNA表达后期明显下降,提示其变化延迟于Per2变化.结论 通过RNAi技术沉默大鼠血管平滑肌细胞中时钟基因Per2表达,使钟基因Bmall反向增强,明显抑制输出基因Dbp的表达,影响其节律,可能造成AGTR1的异常延后表达.
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模拟失重对大鼠动脉血压、心率昼夜节律的影响及其机制
目的 探讨模拟失重对大鼠尾动脉血压、心率昼夜节律的影响及相关的机制.方法 采用尾悬吊后肢去负荷模型地面模拟太空微重力环境对心血管系统的影响.18只8周龄雄性SD大鼠随机均分为尾悬吊组(SUS组,尾悬吊28d后进行实验)和对照组(CON组,常规饲养,不行尾悬吊).每3h测量大鼠尾动脉血压及心率;采用血管环实验测定腹主动脉收缩能力的昼夜差异;蛋白免疫印迹实验分别检测视交叉上核(SCN)和腹主动脉组织中时钟基因Per2(Period2)、Bmal1及dbp的昼夜表达水平.结果 大鼠经28d模拟失重后,与对照组比较,尾动脉收缩压、舒张压均出现显著下降且昼夜差异消失;心率显著增加且昼夜差异消失;腹主动脉的收缩反应性下降且昼夜差异消失;SCN和腹主动脉组织时钟基因表达的昼夜差异也趋于消失.结论 28天模拟失重可导致大鼠心血管系统节律紊乱,可能与时钟基因表达异常密切相关.
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血管紧张素Ⅱ对乳大鼠心肌细胞时钟基因表达的影响
目的为研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)致左心室肥厚是否与时钟机制有关.方法分离纯化培养的7 d龄乳大鼠心肌细胞,分别加入AngⅡ和(或)替米沙坦(Tel)处理,然后提取总RNA,用RT-PCR检测评价心肌细胞时钟基因(Bmal1, mPer2, Dbp)的转录水平.结果与对照组心肌细胞相比,0.1 μmol·L-1 AngⅡ处理72 h使心肌细胞时钟基因转录水平显著上调;0.1 μmol·L-1 Tel能拮抗0.1 μmol·L-1 AngⅡ对心肌细胞时钟基因转录上调的作用.结论在正常培养乳大鼠心肌细胞中,时钟基因以日周期节律方式振荡表达,AngⅡ诱导其表达增强,Tel从受体水平拮抗AngⅡ的诱导作用.
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时钟基因、近日节律与抑郁症关系的研究进展
临床研究已经发现抑郁症具有近日节律的变化,其中为突出的就是睡醒周期的改变.随着对节律基因的深入研究,这种近日节律的变化与抑郁症的关系正日益受到广泛关注.
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时钟基因DBP在抗Thy-1肾炎模型肾小球中的变化规律
目的 研究时钟基因-白蛋白D位点结合蛋白(albumin D site-binding protein,DBP)基因在抗Thy-1肾炎模型中随时钟的表达变化,以证明时钟基因参与系膜增殖性肾炎发病进程的调控.方法 利用尾静脉注射抗Thy-1抗体制备SD大鼠系膜增殖性肾炎模型;于注射抗体后3d和5d的10:00、16:00处死动物,正常对照组注射PBS溶液,并于0d的10:00、16:00处死.每个时间点需要5只大鼠.利用PAS染色检测系膜增殖和细胞外基质积聚,利用Trizol方法提取RNA,利用qRT-PCR检测DBP基因的表达变化.结果 抗Thy-1肾炎模型肾小球自1d起出现系膜溶解,炎症细胞浸润,至3d溶解为明显,5d溶解消失,系膜细胞开始明显增殖,系膜基质明显增多.抗Thy-1模型的肾小球中,3d和5d10:00的DBP mRNA相对表达量高于正常大鼠,且5d的16:00时DBP mRNA相对表达量明显高于正常大鼠.但是在肾皮质中,抗Thy-1模型组与正常大鼠相比,DBP mRNA相对表达量并无显著差异.结论 DBP在抗Thy-1肾炎模型肾小球中表达上调,提示时钟基因参与了系膜增殖性肾炎的疾病进展过程.
关键词： 系膜增殖性肾炎 白蛋白D位点结合蛋白 时钟基因 大鼠 -
反转录巢式多重聚合酶链式反应体系检测单细胞中时钟基因表达
目的 建立一种高度灵敏的能够在单细胞水平检测时钟基因表达的反转录巢式多重聚合酶链式反应(multiplex nested reverse transcription-polymerase chain reaction,multiplex nested RT-PCR)体系.方法 选取核心时钟基因bmal1,clock,per1,per2,cry1和cry2,以及看家基因β-actin,分别设计和优化巢式引物对.以基因质粒为模板,检测巢式多重PCR体系的灵敏度.体外转录得到各个基因的RNA模板,并检测反转录巢式多重PCR体系的灵敏度.使用手动微操作器,显微镜下负压获取悬浮单个NIH/3T3细胞,使用反转录巢式多重PCR体系检测其中目的时钟基因.应用实时定量PCR检测整体水平时钟基因表达情况,与单细胞水平进行比较.结果 巢式多重PCR检测体系可以检测出单拷贝质粒DNA.反转录巢式多重PCR能够检测出4拷贝RNA模板.利用上述体系发现,NIH/3T3单细胞中时钟基因环路表达存在很大差异,同时发现群体水平per1和per2表达的高峰和低谷间差异有统计学意义,而单细胞水平per1表达则差异无统计学意义.结论 建立了高度灵敏的用于检测时钟基因表达的反转录巢式多重PCR体系,揭示了单细胞水平时钟基因表达的异质性,也验证了整体水平与单细胞水平时钟基因表达的差异.
关键词： 反转录巢式多重聚合酶链式反应 时钟基因 单细胞 NIH/3T3 -
MPTP对C57BL/6J小鼠脑时钟基因mPer1 mRNA表达的影响
目的 研究神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四羟基吡啶(MPTP)对小鼠脑组织中时钟基因mPer1 mRNA表达的影响.方法 将C57 BL/6J小鼠用计算机辅助法随机分为MPTP组和对照组,MPTP组腹腔注射MPTP-HCl,对照组注射0.9%氯化钠注射液,连续5 d,第11天连续24 h按6个时间点取材.用HPLC-ECD检测纹状体中多巴胺(DA)含量,用实时定量RT-PCR检测纹状体和其余脑组织mPer1 mRNA水平.结果 MPTP组纹状体DA水平较正常对照组减少了80%,并维持低水平长达10 d;纹状体mPer1 mRNA在24 h内呈明显节律性变化,而其余脑组织mPer1 mRNA无明显节律性变化;MPTP处理导致纹状体和其余脑组织mPer1 mRNA水平增高及纹状体mPer1 mRNA表达高峰提前.结论 MPTP引起小鼠纹状体时钟基因的表达水平和节律性发生改变,提示MPTP可能通过改变细胞内的节律控制中心而影响机体的生物节律.
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3 xTg-拟 AD小鼠脑内七种时钟基因启动子区甲基化分析
目的：应用新的动物模型，建立一种快速简便的方法检测7种主要时钟基因per1、per2、cry2、clock、npas2、bmal1和bmal2启动子区甲基化状态，探索阿尔茨海默症引起的生理节律紊乱机制。方法采用甲基化特异性PCR（ MSP）法，检测15例3xTg拟阿尔茨海默症（ Alzheimer’ s disease，AD）小鼠和15例转基因阴性对照小鼠全脑7种时钟基因启动子区CpG岛甲基化水平。结果在转基因阳性小鼠中检测到3例cry2基因、1例clock和1例bmal2时钟基因发生甲基化现象，在对照组小鼠中未检测到时钟基因甲基化。结论启动子区甲基化这种表观遗传学修饰参与节律基因表达的调控，可能是AD疾病中时钟节律紊乱发生的重要原因。
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帕金森病患者时钟基因启动子区甲基化分析
目的 分析帕金森病(Parkinson,s disease,PD)患者和正常老年对照组时钟基因启动子区甲基化水平,探讨帕金森病患者时钟基因异常表达的机制.方法 采用甲基化特异性PCR(MSP)法,检测206例帕金森病患者和181例正常老年对照者的7种时钟基因启动子甲基化水平.结果 7种时钟基因中,cry1和npas2启动子区存在明显甲基化.另5种时钟基因启动子(per1、per2、cry2、clock、bmal1)未发现明显甲基化.PD患者中npas2甲基化频率明显下降.结论 PD患者时钟基因的异常表达可能与时钟基因启动子区甲基化的改变有关.
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启动子区E-box以及周围CpG岛的甲基化与基因节律性表达的关系
目的 探讨mPer2、mCr1和mDBP启动子区E-box以及周围CpG岛的甲基化是否影响E-box和BMAL1/CLOCK基因和蛋白相互作用的方式；以及启动子区的甲基化状态是否影响MAP激酶磷酸化酶l(MAP kinase phosphatise 1,MKP1)的组织特异性表达调控.方法 分6个时间点取C57 BL/6J小鼠的肝脏和肾脏,提取DNA,通过重硫酸盐处理基因组DNA,以及测序检测E-box和周围CpG岛的甲基化状态.结果 mper2、mCry1和mDBP启动子区E-box以及周围CpG岛无明显甲基化状态,肝脏和肾脏中MKP1的E-box以及周围CpG岛亦无明显甲基化状态.结论 节律基因的启动子区E-box以及周围CpG岛的甲基化不参与节律基因表达的目节律性调控.
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时钟基因与昼夜节律在缺血性心脏病中的研究进展
缺血性心脏病是一种常见的临床疾病.心肌组织缺血缺氧导致心肌细胞坏死,进而产生心脏泵血功能以及循环障碍,严重影响人类健康及生活质量.研究表明,急性心肌梗死的发生率在一日中呈周期性节律振荡,并在早晨至上午这一时段达到高峰.时钟基因与昼夜节律参与缺血性心脏病病程的机制已成为近年来研究的重点.大量研究表明,时钟基因与昼夜节律的紊乱通过调节代谢、自噬与氧化应激水平,介导血管损伤,影响心肌缺血/再灌注损伤,在缺血性心脏病的发生发展中发挥着重要作用.
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慢性睡眠紊乱与胰岛素抵抗的相关性研究
目的 探究SD大鼠慢性睡眠紊乱后与胰岛素抵抗发生的相关性及其潜在机制.方法 选取SPF级SD雄性大鼠30只,随机分为慢性睡眠紊乱组和对照组,每组各15只.从两组中各随机选取5只大鼠处死,进行胰岛时钟基因表达的基线数据采集,其余大鼠进行后续实验.慢性睡眠紊乱组通过经典水平台法诱导慢性睡眠紊乱模型,对照组置于不含水的平台玻璃笼中,实验干预4周后,观察两组大鼠体重变化,测量空腹血糖、空腹胰岛素以及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)水平,同时应用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测胰岛昼夜节律时钟基因转录表达水平变化.采用SPSS18.0软件进行t检验.结果 实验造模前两组大鼠基线数据中各指标比较差异均无统计学意义(P＞0.05),干预4周后,与对照组相比,慢性睡眠紊乱组体重明显增加,空腹胰岛素水平、胰岛素抵抗指数明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);胰岛时钟基因CLOCK、BMAL1、PER1基因转录表达水平下调,而CRY1基因转录表达水平明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);PER2、PER3、NR1D1在转录水平表达变化差异无统计学意义(P＞0.05).结论 慢性睡眠紊乱可改变部分大鼠胰岛核心时钟基因的转录表达水平,引起大鼠体重的增加,与胰岛素抵抗的发生密切相关.
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冠心康对ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠心脏时钟基因昼夜节律的影响
目的:观察中药复方制剂冠心康对Apo E基因敲除动脉粥样硬化小鼠血管壁保护及斑块的稳定作用及心脏时钟基因的调节,探讨中药干预高脂血症、动脉粥样硬化,防止心血管疾病发生的可能机制.方法:在12h光照/黑暗条件下,54只Apo E-/-小鼠西方膳食饲料饲养至12周龄并随机分为3组,模型组、冠心康组以及辛伐他汀组,每组18只.另18只C57BL/6/J小鼠直接分至正常组.正常组及模型组每日给予生理盐水灌胃,辛伐他汀以及冠心康组每日分别予以相应药物灌胃.观察至19周龄取材.设定昼夜时点(Zeitgeber time,ZT),并根据ZT于ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16与ZT20依次取材；采用HE染色法观察载脂蛋白E基因敲除动脉粥样硬化小鼠主动脉壁损伤情况；运用RT-PCR检测技术,检测载脂蛋白E基因敲除动脉粥样硬化小鼠心脏时钟基因Bmal1、Per2 mRNA表达水平.结果:病理研究结果提示冠心康具有一定的抗动脉粥样硬化作用.ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠心脏时钟基因昼夜表达节律与正常组比较,显著改变,提示Bmal1、Per2存在昼夜表达异常；冠心康可显著调节Bmal1及Per2基因表达昼夜节律.其中与模型组相比,冠心康组小鼠心脏Per2基因在早上8点、下午16点以及午夜0点表达含量有显著差异,P＜0.05.其中在下午16点表达显著升高,而在上午8点及午夜0点表达显著降低.与模型组相比,冠心康组小鼠心脏Bmal1基因在早上8点及午夜0点表达含量均显著升高,P ＜0.05,其基因表达水平与正常组较为相似.结论:冠心康对ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠存在抗动脉粥样硬化的作用；冠心康对ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠心脏时钟基因Bmal1、Per2基因表达节律存在干预作用,可能是中药干预动脉粥样硬化的分子机制之一.
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脑胶质瘤组织NPAS2时钟基因启动子区甲基化与预后的关系
目的 探讨脑胶质瘤组织NPAS2时钟基因启动子区甲基化与预后的关系.方法 采用甲基化特异性PCR检测102例脑胶质瘤组织及其癌旁正常组织NPAS2时钟基因启动子区甲基化状态,并分析脑胶质瘤组织NPAS2时钟基因启动子区甲基化状态与患者临床特征、5年总生存期的关系.结果 脑胶质瘤组织NPAS2时钟基因启动子区甲基化频率明显高于癌旁正常组织(P＜0.05).WHO分级Ⅲ ～ Ⅳ级脑胶质瘤组织NPAS2时钟基因启动子区甲基化频率明显高于Ⅰ～Ⅱ级脑胶质瘤组织(P＜0.05).肿瘤全切除与否(HR=0.585,95％CI:0.353～0.969,P＜0.05)、肿瘤直径(HR=1.970,95％ CI:1.196～3.243,P＜0.05)、WHO分级(HR=1.786,95％CI:1.110～2.874,P＜0.05)、脑胶质瘤组织NPAS2时钟基因启动子区甲基化状态(HR=2.115,95％ CI:1.223～3.656,P＜ 0.05)是影响患者5年总生存期的独立危险因素.结论 NPAS2时钟基因启动子区甲基化与脑胶质瘤恶性程度有关,其甲基化修饰是脑胶质瘤患者长期预后不良的独立危险因素.
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脑胶质瘤组织时钟基因启动子区甲基化状态及意义
目的 探讨脑胶质瘤组织中PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、BMAL1和NPAS2时钟基因启动子区甲基化状态与脑胶质瘤发生、发展的关系.方法 采用甲基化特异性PCR检测脑胶质瘤组织及其癌旁正常组织(对照)PER1、CRY1、CRY2、CLOCK、BMAL1、NPAS2等时钟基因启动子区甲基化状态.结果 脑胶质瘤组织与癌旁正常组织中PER1、CLOCK时钟基因启动子区均未有甲基化;脑胶质瘤组织中NPAS2、PER2时钟基因启动子区甲基化频率明显高于癌旁正常组织(均P＜0.05);两种组织中CRY1、CRY2和BMAL1时钟基因启动子区甲基化频率比较,差异均无统计学意义(均P＞0.05).不同级别脑胶质瘤组织中PER1、CLOCK时钟基因启动子区均未有甲基化;高级别脑胶质瘤(Ⅲ～Ⅳ级)组织中NPAS2时钟基因启动子区甲基化频率高于低级别胶质瘤(Ⅰ～Ⅱ级)组织(P＜0.05);不同级别脑胶质瘤组织中CRY1、CRY2、BMAL1和PER2时钟基因启动子区甲基化频率比较,差异均无统计学意义(均P ＞0.05).结论 NPAS2、PER2时钟基因启动子区甲基化频率明显增高;NPAS2时钟基因启动子区甲基化频率越高,脑胶质瘤的恶性程度越高.NPAS2、PER2时钟基因启动子区DNA甲基化修饰可能是脑胶质瘤发生、发展的重要机制.
