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基因释放剂对痰中耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变检出率的影响
结核分支杆菌DNA依赖性RNA聚合酶β亚单位编码基因(rpoB)是单拷贝基因,提高其检测灵敏度对直接检出痰中耐利福平结核分支杆菌具有重要意义.我们在聚合酶链反应-单链构象多态性分析中(PCR-SSCP)采用基因释放剂和套式PCR,提高痰标本中结核杆菌rpoB基因突变检出率,以快速确定是否为耐药菌感染.
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浙江省淡色库蚊钠离子通道基因单链构象多态性分布特征研究
目的 了解浙江省不同地区淡色库蚊钠离子通道(vssc)基因多态性分布特征.方法 采集杭州、舟山、湖州、金华等市区淡色库蚊样本,PCR扩增vssc基因片段,扩增产物进行基因单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)分析.对不同的SSCP型进行测序,并进行氨基酸序列预测.结果 四地市淡色库蚊现场品系以及敏感品系vssc基因片段经SSCP分析共发现7个SSCP型,分别属于3个不同的氨基酸序列型,即野生型、L1014S突变型以及L1014F突变型.结论 浙江省淡色库蚊t,ssc基因存在较高的多态性,使其在面对菊酯类等相关杀虫剂选择压力时具有较高的耐受度,进而可能会增大相关杀虫抗性防制的难度.
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肺癌呼吸道合胞病毒感染与K-ras基因突变的研究
近年肺癌的发生率呈上升趋势,有专家认为人乳头瘤病毒感染与肺癌有关[1,2].我们在临床检测中发现肺癌患者上呼吸道分泌物中的呼吸道合胞病毒(RSV)阳性检出率较呼吸道感染患者高.本研究应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)结合单链构象多态性分析(SSCP)、免疫组化分析检测39例肺癌手术标本的BSV和K-ras基因.探讨肺癌与RSV感染和K-ras基因突变的关系.
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食管鳞状细胞癌p53基因突变与p53蛋白过度表达的关系
p53基因是各种人类肿瘤包括食管癌中常见有突变的基因之一.我们应用激光显微切割,聚合酶链反应(PCR)-杂合性缺失(LOH),PCR-单链构象多态性分析(SSCP),p53测序及免疫组织化学方法,检测了食管癌高发区中国山西省的56例患者食管鳞状细胞癌 (ESCC) 中p53基因缺失、突变及p53蛋白表达情况,旨在更好理解p53基因突变等变化在食管癌发生发展过程中的作用.
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贵州地区感染外阴阴道念珠菌病的白念珠菌微卫星多态性研究
目的:调查贵州地区感染外阴阴道念珠菌病( vulvovaginal candidiasis , VVC)的白念珠菌CAI区微卫星基因型分布及其与当地VVC流行病学之间的关系。方法收集贵州地区90株引起VVC的白念珠菌菌株,对其进行CAI区单链构象多态性( single strand conformation polymorphism , SS-CP)及GeneScan分析,对贵州地区VVC患者白念珠菌进行了基于CAI区微卫星分型,运用SPSS19.0软件对分离的白念珠菌进行基因多态性及聚类分析,并采用logistic 回归模型分析白念珠菌CAI区微卫星基因型分布与VVC的关系。结果90株VVC来源的白念珠菌中共有27种CAI-SSCP 图谱,结合GeneScan 分析结果证实为27种基因型,3种主要优势基因型30-45、32-46、30-46以及其他7种与其非常接近的基因型共63株,占70.0%;聚类分析将贵州地区白念珠菌分为3个群系( ClusterⅠ~ClusterⅢ),其中优势基因型全部聚类为Cluster Ⅱ;logistic 回归分析显示,白念珠菌优势基因型对VVC具有高危险度比值比(OR=4.3)。结论贵州地区感染VVC的白念珠菌的CAI基因型呈明显的优势分布,这些优势基因型与贵州地区VVC的发生高度相关。
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结核分枝杆菌对乙胺丁醇耐药突变基因检测方法的建立
乙胺丁醇(EMB)是一线抗结核药物,近的研究结果表明,结核分枝杆菌(结核菌)对EMB耐药的产生与阿拉伯糖基转移酶编码基因embB改变有关.其中embB基因(尤其是306位密码子)突变是产生对EMB耐药的主要分子机制.聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)是近年发展起来的常用的基因突变分析技术,结合染色法(silver staining),使其应用前景更为广阔.我们应用PCR-SSCP银染技术和PCR-直接测序法对河南省耐药监测中收集的87株结核分离株embB基因进行了研究.
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聚合酶链反应-单链构象多态性检测淋病奈瑟菌gyrA基因突变的研究
国外研究表明,DNA旋转酶是淋病奈瑟菌(淋菌)中氟喹诺酮类药物的首要作用靶位,淋菌对氟喹诺酮类药物耐药主要与编码该酶的gyrA基因喹诺酮耐药决定区(QRDR)突变有关[1].为建立一种简便、快速、可靠的淋菌gyrA基因突变的检测方法,并进一步探讨该突变与我国临床分离淋菌对氟喹诺酮类药物耐药的关系,本课题以浓度梯度(Etest)法检测了42株临床分离淋菌对环丙沙星敏感性,采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)结合DNA测序技术,对淋菌gyrA基因QRDR突变进行了研究,报告如下.
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先天性巨结肠症RET和EDNRB基因的突变
目的:了解中国人群先天性巨结肠症(HD)发病与RET基因,EDNRB基因突变的关系,及同一患者是否两个基因同时突变的状况.方法:随机将HD患者分2组,即检测RET/EDNRB组(A组)56例及EDNRB组(B组)40例,同时设二个相同数量对照组(C组).每人采集外周静脉血2-3 mL经盐析法提取DNA后,应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法,对RET基因20个外显子中的第6,13,15,17外显子(E6,13,15,17)和EDNRB基因7个外显子中的第4,5,6外显子(E4,5,6)进行基因突变的检测,将突变样品进行自动测序分析.结果:A组中2例散发性患者的E13,E17扩增片段在SSCP分析时有泳动变位,并经DNA自动测序仪检测为基因多态,CTG→CTT,Leu769→Leu,散发性突变频率为4%(2/48);2例家族性患者的E15扩增片段在SSCP分析有泳动变位,DNA测序1例为错义突变Lys889→Thr,另1例为两个同义突变GTGAAGAGGAGCCA→GTTAAGAGGAGTCA分别在V906和S909密码子上,家族性突变频率为25%(2/8);1例散发性短段型患者EDNRB基因E5在SSCP分析时有泳动变位未能测序;B组中1例散发性短段性患者EDNRB基因的E4在SSCP分析有泳动变位,经DNA测序证实在核苷酸位点831,密码277上G→A的置换,Leu277→Leu为司义突变,突变频率为2.7%(1/37),家族性3例患者未检测出突变.C组未检出RET,EDNRB基因的突变.家族性患者与散发性患者RET突变结果经统计学处理x2=4.95,P<0.05,OR=8,OR95CI=1.28-49.87.结论:中国人群的先天性巨结肠症发生确实与RET和EDNRB基因突变有关,家族性HD患者RET基因突变达25%,散发性HD患者主要以EDNRB基因突变为主,无1例患者有RET和EDNRB两个基因同时突变.同时显示有家族史比没有家族史发生HD的危险性大8倍,其可信限在95%.
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K-ras基因在胰腺癌和慢性胰腺炎中突变和表达异常及其临床意义
目的:探讨Ras蛋白过度表达与胰腺癌和慢性胰腺炎临床病理的关系,以及K-ras突变在慢性胰腺炎中的临床意义和在胰泉癌诊断中的价值.方法:应用EnVision显色系统免疫组化方法分别检测胰腺癌组织(24例)、癌旁组织(77例)、手术切缘正常组织(16例)和慢性胰腺炎(24例)石蜡包埋组织中P21 ras的表达情况.应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法分别检测胰腺癌、癌旁组织、手术切缘正常组织、慢性胰腺炎石蜡包埋组织的K-ras突变并进行DNA测序确认.结果:P21 ras在胰腺导管腺癌组织中的表达阳性率为58.3%(14/24),与慢性胰腺炎胰腺导管增生组织的P21 ras表达阳性率45.8%(11/24)相比,二者差异无显著性(P>0.05):P21 ras在良、恶性胰腺疾病增生性病变中的表达阳性率为36.6%(30/82),与其在正常胰腺组织中的表达阳性率(0%)相比,有显著性差异(P<0.05);P21 ras蛋白在正常胰腺组织、导管增生性病变、导管不典型增生中的表达阳性率分别为0%、36.6%和78.9%,呈渐进过程,而且增生性导管病变与不典型增生相比,P21 ras表达阳性率的差异具有显著性(P<0.05).胰腺癌K-ras12密码子突变率(79%)显著高于慢性胰腺炎(33.3%)(P<0.01),且在切缘正常组织→癌周导管增生→癌周不典型增生→胰腺癌过程中,突变率有逐渐上升的趋势.突变方式以12密码子GGT→GAT、GTT、CGT为主且同1例患者突变方式一致.结论:P21 ras过度表达和K-ras基因突变在胰腺癌发生中起到作用,但K-ras基因突变作为胰腺癌诊断的分子标志缺乏特异性.
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结直肠癌组织中DPC4基因的分子生物学研究
目的:检测DPC4基因在结直肠癌及其癌旁组织中的失活.方法:采用聚合酶链反应(PCR)、单链构象多态性分析(sSCP)检测30例结直肠癌及其癌旁组织的DPC4基因失活情况.结果:30例结直肠癌组织标本中3例出现DPC4基因缺失,4例出现DPC4基因第11位外显子突变;而其癌旁组织则无DPC4基因突变或缺失,有显著性差异.结论:DPC4基因作为一个抑癌基因,参与了结直肠癌的发生.
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中国特发性扩张型心肌病患者与δ-肌聚糖基因的相关性研究
目的探讨中国特发性扩张型心肌病是否与δ-肌聚糖基因(SGCD)的突变相关.方法用人工合成的寡核苷酸引物,通过聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性分析(SSCP)-DNA测序法对70名特发性心肌病患者和70例健康对照SGCD基因的全部9个外显子进行分析.结果在病例组和对照组外显子2,3,6,9 m,9p的单链构象多态性图谱均呈相同形态,DNA测序发现两组的核苷酸序列没有差异;经反复改变电泳条件仍未能分离出外显子4,5,7,8的SSCP电泳条带.结论未证实δ-肌聚糖基因(SGCD)是特发性心肌病患者的致病基因.
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一个2型糖尿病家系ATP敏感性钾通道基因突变分析
目的 了解ATP敏感性钾通道(KATP)基因突变在一个2型糖尿病(T2DM)家系中的发生情况.方法 提取家系成员的外周血DNA,用PCR扩增磺酰脲类受体1(SUR-1)基因第16、18、31外显子和KIR 6.2基因,用单链构象多态性分析(SSCP)检测PCR产物,对SSCP电泳结果异常者进行DNA序列分析.结果 (1)在17名家系成员中,未检测到SUR-1基因第18号外显子ACC→ACT和第31外显子AGG→AGA突变;(2)SUR-1基因第16号外显子-3C→T的T等位基因频率为65%,比普通T2DM人群高8%;(3)KIR6.2基因E23K的K等位基因频率38%,比普通T2DM人群低3%.结论 SUR-1基因第16号外显子-3C→T多态性可能与饮食、环境等因素共同作用,参与该家系T2DM的发生和发展.
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特发性扩张型心肌病与δ-肌聚糖基因相关性研究
目的探讨特发性扩张型心肌病患者中是否有δ-肌聚糖基因的突变.方法用人工合成的寡核苷酸引物,通过聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性分析(SSCP),结合DNA测序对δ-肌聚糖基因的可疑突变部位外显子6与外显子9p进行分析.结果分析了50例扩张性心肌病患者和50例对照组该基因的外显子6和外显子9p,在非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳中,未发现异常构象,通过DNA测序证实两组的核苷酸序列没有差异.结论小样本研究未能证实δ-肌聚糖基因是扩张性心肌病患者的致病基因.
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胃间质瘤中p16基因缺失和突变的研究
本研究应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCRSSCP)的方法对胃问质瘤(gastric stromal tumors,GST)中p16基因外显子2的缺失和突变进行检测,目的在于探讨GST中p16基因外显子2缺失和突变的情况及其临床意义.
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乳腺癌及卵巢癌组织BRCA1基因突变的检测
乳腺癌和卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤.1994年,第1个卵巢癌、乳腺癌易感基因BRCA1被成功克隆[1].为探讨BRCA1基因在乳腺癌、卵巢癌发生中的潜在作用,我们应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)及多重异源双链分析( MHA)方法对56例乳腺癌及34例卵巢癌患者的癌组织标本进行BRCA1基因突变的检测.
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喉鳞癌中人乳头瘤病毒感染与p53基因突变的关系
目的:探讨抑癌基因p53突变和人类乳头状瘤病毒16,18型(HPV16,18)感染与喉鳞癌的关系及二者在喉鳞癌中的相关性.方法:应用聚合酶链反应结合单链构象多态性分析(PCR-SSCP)技术对40例喉鳞癌组织中HPV16,18DNA及p53基因第5,7外显子的突变进行检测.结果:HPV16,18的检出率分别为35%(14/40)和10%(4/40).12例(30%)标本p53基因突变,其中第5外显子10例(25%),第7外显子2例(5%),p53基因在HPV阳性和阴性标本中的突变率分别为33.3%和27.3%,二者差别无显著性(χ2=0.1732,P>0.05).结论:HPV感染和p53基因突变在喉鳞癌的发生发展过程中都起重要作用,但二者之间无相关性.
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慢性粒细胞性白血病不同病期p53基因突变检测及临床意义
人类慢性粒细胞性白血病(CML)p53基因突变的研究是近年来国内外研究热点之一,我们应用多聚合酶链反应-单链构象多态性分析(single stra nd conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction,PCR-SSCP)技术检测26例30份不同分期慢性粒细胞白血病p53基因突变.
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膀胱癌患者体液中线粒体基因HV1突变的检测及临床意义
近年来发现,在体液中可以检测到肿瘤细胞核DNA[1,2],但由于数量较少,以及正常DNA的稀释作用,检出率较低.线粒体DNA(mitochondria DNA,mtDNA)区别于核DNA的特点有两个:其一,它缺乏损伤修复机制,可能会先于核DNA而受到环境因素的影响并持续存在;其二,mtDNA数量多,复制率高,可能更易于检测.为此我们应用单链构象多态性分析(SSCP)法检测了膀胱癌患者血浆和尿液中mtDNA调控区的HV1区(mtDNA 16024-16383)突变,并与核基因p53检测进行对照.现将结果报道如下.
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胃肠道淋巴瘤TCRγ基因重排分析及其意义
胃肠道淋巴瘤是常见的结外淋巴瘤之一,其诊断较为复杂,误诊率高.诊断通常要根据临床症状、形态学、免疫组织化学和分子生物学等综合判断.由于T细胞受体γ(TCRγ)基因重排发生在T细胞分化的早期,并且在两种不同表型的T细胞(αβ和γδ)中都存在TCRγ基因重排,因此,TCRγ基因重排成为检测淋巴瘤T细胞单克隆基因重排常用的靶基因.我们选用TCRγ通用引物,采用PCR、琼脂糖凝胶电泳及单链构象多态性分析(SSCP),检测并分析了40例胃肠道淋巴瘤基因重排的情况,探索这些方法在胃肠道淋巴瘤诊断和研究中的意义.
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胃腺癌原发灶与淋巴结转移灶p53基因点突变的研究
p53基因是体内重要的细胞调节基因[1],其突变在人类肿瘤发生中具有重要的作用.95%突变集中在第5~9外显子[2].目前对胃癌原发灶及淋巴结转移灶p53基因突变对比研究的报道较少,我们用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测47例胃癌原发灶与淋巴结转移灶p53基因第7外显子的突变情况,旨在探讨p53基因突变与胃癌生物学特性之间的关系.