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宿主菌抗噬菌体机制的研究进展
噬菌体又称细菌病毒,是公认丰富的微生物,也是多样性的,这种多样性是适应所面对选择性压力例如普遍存在宿主菌的噬菌体抗性机制.噬菌体通过6步(吸附、注入、复制、转录翻译、组装和释放)侵入细菌并使之裂解,但是当噬菌体感染细菌,就会面临细菌抗噬菌体的机制,宿主菌能够进化出多种抗噬菌体的机制来避免噬菌体的侵染和裂解.本文就对宿主菌抗噬菌体各种机制作一综述.
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地高辛标记探针检测重组白细胞抑制因子-水蛭肽嵌合蛋白宿主DNA残留量的研究
重组白细胞抑制因子-水蛭肽嵌合蛋白( recombinant neutrphil inhibitory factor and hirulog hybrid,TNHH)是一种通过基因工程技术改造的新型嵌合蛋白,临床上可用于急性脑栓塞后的脑组织损伤修复,减少脑水肿,防止微小血栓形成从而改善微循环,是一种有前景的心脑血管疾病治疗创新药物,目前已进入临床 I、II 期研究[1-2]。由于在生产过程中使用了工程菌大肠杆菌,而宿主菌的残留 DNA 是重组药物中特有的潜在致癌性杂质,可能会随药物一同进入人体终致癌,因此对 TNHH 原液中外源性 DNA 残留量的检测极为重要[3]。
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一株HIV1变异株的发现
我们在进行序列分析过程中发现一株不同于以往国内外报道的新型HIV1的变异毒株。现报道如下:1 材料和方法1.1 前病毒DNA的提取某HIV1感染者300μLEDTA抗凝血,使用Promega公司的DNA提取试剂盒(Wizard GenomicDNA Purification Kit)提取HIV1前病毒DNA。1.2 HIV env基因c2-v3区的套式PCR扩增 以所提的HW1前病毒DNA为模板,利用一对外侧引物EP1,EP2(序列为,EP1:5'-GGCAGTCTAGCA-GAAGAAGAGG-3':EP2:5'-CCTACTTC-C TGCCACATG-3')和一对内侧引物EP3,EP4(序列为,EP3:5'-GATCTGA-CAATTTCACGAACAAT TGC-3';EP4:5'-C TGGGTCCCCTCCTGAAGGATG-3')进行nested-PCR反应。反应条件为94qC30s,55℃30s,72℃30s,35个循环;72℃C5min结束扩增。1.3 PCR扩增片段的克隆P CR扩增的特异性片段经Promega公司的PCR产物纯化试剂盒(WizardPCRprepsDNA pu-rification system)纯化后,与PGEM-T载体连接克隆于JM109宿主菌中
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重组分枝杆菌噬菌体检测分枝杆菌活力的研究
重组的可表达荧光素酶的分枝杆菌噬菌体,由于可特异地感染宿主菌--分枝杆菌并在宿主菌中快速增殖,同时表达荧光素酶,因此通过检测荧光素酶的浓度即可快速检测分枝杆菌的活力.
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黑曲霉菌pyrG基因的克隆与黑曲霉菌同源转化系统的建立
黑曲霉菌(Aspergillus niger)是一种不产生黄曲霉毒素的丝状真菌,它有生长迅速、易于培养、可大量产生分泌性蛋白质的特点,因此它除了在生产各种真菌代谢物及酶类的发酵工业上被广泛应用外,在基因工程中作为宿主菌生产蛋白质产物方面也受到很大重视和应用。为了将待表达的基因导入宿主菌,首先需要建立一个稳定有效的基因转化系统。以乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶(pyrG)基因作为标志基因并以该基因的缺陷株真菌作为受体菌的转化系统已被证明是一种十分行之有效的基因转化系统。乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶是尿嘧啶核苷酸合成中一种关键性酶,缺乏该酶的pyrG缺陷株不能在不含尿嘧啶核苷的培养基上生长。通过基因转化,向其导入含pyrG基因的质粒,可使其获得在不含尿嘧啶核苷培养基上生长的能力。如果将要导入的基因连接在该质粒上,此时pyrG可作为基因是否导入的标志。我们首次从黑曲霉菌ATCC 12049野生型菌株的基因文库中克隆获得全长pyrG基因,并在此基础上构建了表达性质粒载体,建立了pyrG基因为标志基因,以同型黑曲霉菌pyrG基因缺陷株为受体菌的同源基因转化系统。
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乙肝治疗性可复制型DNA疫苗pSVK-HBVA高稳定宿主菌的筛选及其基础培养基的选择
目的 为乙肝治疗性可复制型DNA疫苗质粒pSVK-HBVA筛选稳定性高,能多次传代的宿主菌,以满足中试工艺的要求,同时对该工程菌适的基础发酵培养基进行选择.方法 将质粒pSVK-HBVA分别转化几种不同的大肠杆菌感受态细胞并提取质粒,通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的形态结构,连续传代法对工程菌的稳定性进行检测;选取质粒含量高和稳定性好的工程菌作为原始种子,按照2010版<中国药典>要求建立工程菌的三级种子批,并对种子批进行鉴定.同时,从LB,TB,M9(甘油),M9(葡萄糖)4种培养基中为工程菌筛选质粒产量高的基础发酵培养基.结果 经过筛选发现,在以大肠杆菌XL10-Gold为宿主菌时,质粒pSVK-HBVA表现出了同常规质粒DNA类似的稳定性,转接传代30次也未发生重组或片段丢失,能满足后续中试工艺的要求,LB作为基础培养基能得到高的质粒容积产率为5.5 mg/L.结论 大肠杆菌XL10-Gold是一个更利于可复制型DNA疫苗质粒pSVK-HBVA扩增的宿主菌,该工程菌发酵的佳基础培养基是LB培养基.
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优化宿主菌在重组系统中构建大容量天然噬菌体抗体库
制备大容量天然噬菌体抗体库.从健康成人外周血和新生儿脐带血中提取淋巴细胞总RNA,反转录后PCR分别扩增抗体重链和轻链基因.将获得的基因片段通过overlap PCR连接为单链抗体基因(scFv),限制性内切酶酶切后连入pDAN5a载体中,连接产物转化大肠杆菌XL2-blue MRF’.与XLl-blue菌株相比,初级库库容增加了3.9倍.再将初级库噬菌体感染含有Cre重组酶的大肠杆菌BS1365,抗体基因在重组酶作用下发生同源重组,终得到库容为1.7×1011的噬菌体抗体库.经检测,该抗体库多样性良好,利用该库可获得针对6种抗原的抗体.以上结果表明,应用XL2-blue MRF’作为抗体基因的转化宿主,提高了噬菌体抗体库的库容,获得的抗体库可用于下一步抗体药物的筛选.
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幽门螺杆菌专题系列讲座(四)Hp的致病因子及遗传多态性(下)
3 Hp致病因子近年研究进展3.1cag致病岛(PAI)1996年Censini等在研究Ⅰ型(VacA阳性,CagA阳性)和Ⅱ型(VacA阴性,CagA阴性)Hp菌株的遗传学差异与致病关系时发现,Ⅰ型Hp菌株具有细菌致病岛的典型特征,因此称其为cag致病岛.其特征为:①含有许多毒力基因;②存在于致病菌株,在无毒株及弱毒株上不存在或很少出现;③其G+C含量与宿主菌不同;④占据较大的染色体区域(通常大于30kb);⑤为一紧密、明确的遗传学单位,两端通常为直接重复序列;⑥其侧面与tRAN基因和(或)插入序列相连;⑦载有(通常为隐性的)"可移动"基因;⑧具有不稳定性.
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新生小牛血清污染大肠埃希菌噬菌体的检测
新生小牛血清是生物制品生产中细胞培养所必需的原材料.小牛血清质量的好坏直接影响细胞生长和生物制品的质量,国家近年来对国内新生小牛血清提出了严格的质量标准,其中检测小牛血清中污染大肠埃希菌噬菌体是一项重要的指标.为了减少小牛血清污染的漏检,我们用2种宿主菌检测小牛血清噬菌体.结果报告如下.
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重组胶原蛋白海绵的制备及性状表征
背景:重组胶原蛋白具有良好的亲水性及生物相容性,但其存在溶解性强及机械强度不足等缺点.化学交联可显著提高材料的韧性、力学强度及耐降解性.目的:制备重组胶原蛋白海绵,并对其理化性质及安全性进行评价.方法:采用微生物发酵法获得重组胶原蛋白,经戊二醛交联后,将其置于模具中冷冻干燥,获得多孔重组胶原蛋白海绵,检测交联后重组胶原海绵的吸水率与孔隙率,采用扫描电镜观察交联前后重组胶原海绵的表面形态,红外光谱仪对比交联前后重组胶原海绵结构的变化.采用交联重组胶原海绵浸提液培养L929细胞,培养第68小时,采用MTT法检测细胞相对增殖率,评估交联重组胶原海绵的细胞毒性.结果与结论:①交联后重组胶原海绵的吸水率为(2903.83±47.90)%,平均孔隙率在85%以上;②扫描电镜显示,交联前,重组胶原海绵的孔隙呈蜂窝状,致密;交联后,重组胶原海绵的孔隙较大,呈板层结构,可看到板层间桥键连接,纵向可看到较大褶皱;③红外光谱显示,交联后的重组胶原海绵特征性化学结构特征无明显变化;④交联重组胶原海绵浸提液培养L929细胞的相对增殖率为84%,细胞毒性为1级,生物安全性良好;⑤结果表明采用戊二醛交联制备的重组胶原海绵,理化性质稳定,生物相容性良好.
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酶标法检测基因工程干扰素半成品中残余宿主菌蛋白含量
基因工程干扰素是一类具有抗病素、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子,被广泛地应用于临床治疗中.根据<中国生物制品规程>基因工程干扰素半成品中残余宿主菌蛋白含量小于总蛋白量的2的要求,我们建立了酶标法用于该项目的检定[1,2].
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东亚钳蝎氯离子通道毒素BmK CTa在大肠杆菌中的异源表达及其对宿主菌增殖的影响
目的 在大肠杆菌中异源表达东亚钳蝎氯离子通道毒素BmK Cta,并观察其对宿主菌增殖的影响.方法 构建BmK CT基因原核表达质粒pExSecI-rBmK Cta,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定.光密度法检测含不同质粒的大肠杆菌BL21(DE3)及空菌在37℃,LB液体培养基中的生长速率.结果 重组原核表达质粒pExSecI-rBmK Cta经PCR、双酶切和测序证明构建正确.目的蛋白的表达量占全菌总蛋白的19.94%,为可溶性表达,且具有良好的反应原性.rBmK Cta的异源表达显著抑制了大肠杆菌在对数生长期的增殖.结论 rBmK Cta在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,且对大肠杆菌的生长具有显著的抑制作用.提示BmK CT可能特异性地作用于宿主菌的氯离子通道,对原核生物的氯离子通道有抑制作用.
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质粒DNA中宿主菌基因组DNA残留检测方法的比较
目的 对检测质粒DNA中宿主菌基因组DNA含量的Southern blot和Real-time PCR法进行比较.方法 PCR扩增宿主菌染色体DNA的16SrRNA片段,以地高辛标记回收的目的 片段为探针,对提取的质粒pcDNAH进行Southern blot.同时根据16SrRNA基因序列设计探针,建立Real-time PCR反应体系和标准曲线,分别检测质粒中宿主菌基因组DNA的含量.结果 应用Southem blot和Real-time PCR检测质粒peDNAH中宿主菌基因组DNA的含量,结果均符合WHO相关标准.结论 两种检测方法各有优缺点,均可用于检测质粒DNA中宿主菌基因组DNA的残留,可根据不同情况,采用不同方法或配套使用.
关键词: 质粒 DNA 宿主菌 Southern blot 实时 PCR -
增殖法检测新生小牛血清中大肠杆菌噬菌体污染
新生小牛血清是生物制品生产中的一种重要原材料,其质量的好坏直接影响到制品的质量,尤其是活疫苗的生产.为提高疫苗的质量,我们用3种大肠杆菌宿主菌,采用增殖法对新生小牛血清进行了大肠杆菌噬菌体检测.现将结果报道如下.
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噬菌体治疗的研究进展
动物实验及临床研究表明,在噬菌体与宿主菌严格配型的基础上,噬菌体是治疗细菌感染的一种有效手段.噬菌体治疗的前景有赖于人们对噬菌体寄生性的基因控制及特异吸附的分子生物学基础的深刻理解.
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A/E大肠杆菌LEE致病岛
致病岛(pathogenecity island)是细菌染色体上编码毒力相关基因的特殊区域,是在细菌学领域对致病性细菌致病机理的研究中出现的一个新概念,是某些致病性细菌在进化过程中适应环境的变化而获得的毒力基因.人们发现在许多病原性细菌中都存在着致病岛,致病岛通常具有以下特点[1]:(1)致病岛是一组编码细菌毒力因子的基因簇,是染色体上一个分子量较大的片段;(2)致病岛两端通常具有重复序列(RS)或插入元件(IS);(3)G+C含量与宿主菌染色体G+C含量有明显差异;(4)不稳定,含有潜在的可移动元件;(5)通常位于细菌染色体tRNA位点上.致病岛的发现与研究为我们了解细菌的致病性及毒力因子提供了新的途径.
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一个新的TonB依赖的基因岛的分子流行病学研究
毒力岛早是用来描述泌尿道致病性大肠杆菌(UPEC)染色体上的两个大分子量、编码许多毒力相关基因的、不稳定的外源DNA片段.细菌毒力岛不仅赋予宿主菌特殊的致病能力或某些性状,而且与细菌进化和新病原菌出现有关.有些基因簇与细菌新陈代谢等功能有关被统称为"代谢岛"或"基因岛".
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大肠杆菌O157噬菌体中vt2基因A、B亚单位的克隆与序列分析
1982年美国亚特兰大疾病控制与预防中心首次报道了由一种罕见的大肠杆菌血清型即O157:H7引起的出血性肠炎,此后的20多年中由O157所致的疾病在全世界范围内都有散发和暴发,尤其以1996年在日本的暴发流行为大家熟知,我国也有从患者、畜禽及肉制品中分离到该菌的报道.已知Vero毒素(Verotoxin,VTs)为该菌的主要毒力因子之一,包括两类生物学特性相似而理化特性及免疫学特性有很大差异的VT1和VT2.流行病调查结果显示,绝大多数临床分离的高毒力O157:H7菌株都单独或联合表达VT2毒素,因此对大肠杆菌O157的vt2毒力基因的研究是尤为重要.据报道编码VT2毒素的基因可能位于温和噬菌体上(编码VT的噬菌体称为VT噬菌体),这些噬菌体具有毒力传递能力,感染宿主菌后能将噬菌体基因整合到细菌染色体上,使宿主菌获得产生相应毒素的能力.国外已有不少有关携带毒力基因噬菌体的研究,但目前国内对大肠杆菌O157的vt研究均集中在检测为主,而未涉及VT噬菌体.因此本文开展了大肠杆菌O157菌株诱导释放的噬菌体中vt基因的研究.
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人趋化因子SLC在大肠杆菌中的表达与初步纯化
目的 确立人趋化因子SLC在大肠杆菌中的表达条件和初步纯化条件.方法 将pET32a(+)/SLC分别转化大肠杆菌AD494(DE3)、BL21trxB(DE3) 、BL21trxB(DE3)plusS,选择佳宿主菌,优化诱导表达的条件,将大量表达的目的蛋白经金属离子亲和层析、除盐、肠激酶酶切、阳离子交换进行初步纯化.结果 pET32a(+)/SLC佳宿主菌为BL21trxB(DE3),优化的表达条件为37℃、1mmol/L IPTG诱导3h,SDS-PAGE分析可见,表达蛋白的大小约为30kd,占菌体总蛋白的50%以上,可溶性蛋白约占50%.用SLC多克隆抗体进行Western blot分析显示,在30kd处出现单一阳性条带,而对照的pET32a(+)/BL21trxB(DE3)诱导菌则无此反应.SLC经一系列纯化步骤得到初步纯化.结论 初步建立pET32a(+)/SLC在宿主菌BL21trxB(DE3)中表达和纯化的方法.