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空泡毒素介导的自噬与胃癌发生机制的研究进展
幽门螺旋杆菌感染是促进胃癌发生的一个主要危险因素,其中空泡毒素(vacuolating cytotoxin A,VacA)因能引起宿主各种效应故在其中起着重要作用.自噬是真核生物进化过程中的高度保守过程,可清除细胞内的病原微生物,对维持机体内坏境起重要作用,并可通过溶酶体对受损、衰老的细胞器及生物大分子等进行吞噬降解,以维持细胞内环境稳定.因暴露时间不同,VacA可造成胃黏膜上皮细胞发生不同的自噬变化,而这与胃癌的发生、转移、预后等密切相关.
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幽门螺杆菌TaqMan MGB探针双重荧光定量PCR检测方法的建立
目的 建立用于幽门螺杆菌快速定量检测和分型的TaqMan MGB探针双重荧光定量PCR方法. 方法 采用Primer Premier 5软件分析设计引物和探针,采用双重荧光定量PCR扩增幽门螺杆菌CagA和VacA基因片段,建立循环数与拷贝数关系的标准曲线.检测临床标本中所含幽门螺杆菌的循环数,用该方法对临床胃黏膜标本进行检测并与标准曲线对比,计算所含幽门螺杆菌的拷贝数. 结果 建立的TaqMan MGB双重荧光定量PCR方法检测幽门螺杆菌质粒的线性范围是102～108拷贝/μl,CagA和VacA基因标准曲线的相关系数分别是0.977 8和0.990 4.29份临床胃黏膜标本的CagA和VacA基因循环数Ct值分别在29～35和30～35之间,幽门螺杆菌拷贝数分别在1.0×101.39～1.0×103.87和1.0×103.06～1.0×103.91之间,且临床标本中的幽门螺杆菌均为Ⅰ型. 结论 建立的TaqMan MGB双重荧光定量PCR法具有敏感、精确、快速的特点,可用于幽门螺杆菌的快速定量检测与分型鉴定.
关键词： 幽门螺杆菌 CagA VacA MGB双重荧光定量PCR技术 -
河北地区健康人群携带幽门螺杆菌的VacA和CagE毒力基因型分析
目的 探讨河北地区健康人群携带幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)的VacA和CagE基因型分布情况,为当地Hp流行病学研究和胃病预防提供参考. 方法 从84名健康体检者胃黏膜组织分离培养Hp,提取DNA,利用PCR方法扩增毒力基因VacA的s基因、m基因、i基因以及CagE基因片段,分析健康人群中Hp流行株的基因型,以及Hp菌株VacA和CagE基因型与健康人群血型、年龄、性别的相关性. 结果 共分离58株Hp,PCR检测VacA基因均阳性,其中VacA基因的s1型阳性率为98.28％,且以s1a亚型为主,占 91.38％;m 区以m1b和m2亚型为主,与62.08％;i区阳性率为75.86％,以i1为主,占58.62％.毒力基因组合分型以s1m2i1和s1m1i1为主,占46.55％.CagE基因阳性率为89.7％,其中以CagE2亚型为主,占87.93％,CagE1亚型占1.72％.不同年龄、性别人群VacA基因亚型构成差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 河北地区健康人群感染的Hp大多含VacA和CagE基因,其致病性均较高.VacA基因以s1a、m2/m1b、i1为主,cagE以cagE2为主,这可能是当地消化道疾病高发的一个重要原因,因此应重视对健康人群的胃部检查,预防Hp感染.
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消化性溃疡及胃癌患者血清CagA VacA抗体研究
细胞毒素相关蛋白(cytotoxin associated protein,CagA)和空泡形成毒素(vacuolating cytotoxin,VacA)是幽门螺杆菌(Hp)相应的CagA,VacA基因编码产生的两种蛋白质,是Hp的重要致病因子,也作为Hp毒力分型的标志[1],与消化性溃疡(PU)、胃癌有密切关系[2,3],由于Hp菌株类型的分布存在明显的地区差异[4.5].我们检测了本地区PU和胃癌患者的血清CagA,VacA抗体.旨在探讨我国东南沿海地区CagA,VacA与PU及胃癌的关系.1材料和方法1.1材料PU76例,男52例,女24例,年龄18岁～74岁;胃癌31例,男28例,女3例,年龄43岁～75岁;慢性胃炎33例,男21例,女12例,年龄24岁～56岁,所有患者均经内镜及病理证实.另设非消化科同期住院患者且无胃病史、近期无消化道症状者28例为对照组,男17例,女11例,年龄33岁～64岁.
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幽门螺杆菌及其相关毒素与口腔扁平苔藓关系的研究
目的 探讨口腔扁平苔藓与幽门螺杆菌及其相关毒素CagA和VacA之间的关系.方法 快速尿素酶检测法检测口腔扁平苔藓患者与正常对照组龈下菌斑中幽门螺杆菌的表达.酶联免疫吸附试验法检测口腔扁平苔藓患者与正常对照组血清中幽门螺杆菌及相关毒素CagA和VacA的表达.结果 60例扁平苔藓患者龈下菌斑中Hp的阳性表达数明显高于正常对照组(P＜0.05),差异有统计学意义;60例扁平苔藓患者血清中Hp-IgG抗体、CagA-HpIgG抗体、VacA-HpIgG抗体阳性表达数明显高于正常对照组(P＜0.05),差异有统计学意义.结论 口腔扁平苔藓的发生与可能与Hp感染及CagA、VacA基因相关.
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应用免疫印迹法探讨血清幽门螺杆菌抗体谱与上消化道疾病的关系
目的：用免疫印迹法检测幽门螺杆菌（Hp）感染中不同血清分型与慢性浅表性胃炎（CSG）、慢性萎缩性胃炎（CAG）、消化性溃疡（PU）和胃癌（GC）的关系。方法：选取确诊为Hp感染的上消化道疾病患者205例，用Western blot法（免疫印迹法）测血清幽门螺杆菌抗体谱，检测Hp抗体分型，分析CagA和/或VacA抗体阳性的表达情况。结果：在Hp现症感染中，CSG、CAG、PU、GC患者的HpⅠ型感染比例明显高于Ⅱ型感染（P<0.01）；PU及GC中HpⅠ型感染率高于CSG（P<0.05）。不同年龄段及不同性别中HpⅠ型感染比例均高于Ⅱ型感染（P<0.01）。各组的Hp I型感染者中以CagA+VacA抗体为主，检出率为77.4%；其中以CSG组低（70.4%）、GC组高（81.8%）。各组CagA+VacA抗体检出率显著高于单一CagA/VacA抗体检出率（P<0.01）。结论：应用免疫印迹法进行幽门螺杆菌血清学分型检测对于上消化道疾病的判断有临床指导意义，Ⅰ型Hp感染更需要进行根治。
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幽门螺杆菌专题系列讲座(四)Hp的致病因子及遗传多态性(下)
3 Hp致病因子近年研究进展3.1cag致病岛(PAI)1996年Censini等在研究Ⅰ型(VacA阳性,CagA阳性)和Ⅱ型(VacA阴性,CagA阴性)Hp菌株的遗传学差异与致病关系时发现,Ⅰ型Hp菌株具有细菌致病岛的典型特征,因此称其为cag致病岛.其特征为:①含有许多毒力基因;②存在于致病菌株,在无毒株及弱毒株上不存在或很少出现;③其G+C含量与宿主菌不同;④占据较大的染色体区域(通常大于30kb);⑤为一紧密、明确的遗传学单位,两端通常为直接重复序列;⑥其侧面与tRAN基因和(或)插入序列相连;⑦载有(通常为隐性的)"可移动"基因;⑧具有不稳定性.
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我公司煤矿工人幽门螺杆菌感染分析
幽门螺杆菌(HP)感染是慢性胃病的主要致病因素.感染后能否致病,主要取决于产毒菌株,主要有细胞毒素相关蛋白A(CagA)及细胞空泡变性毒素(VacA)HP菌株[1,2],这2种毒力型菌株具有很强的致病毒力,其产生的细胞毒素,能导致机体产生免疫答应,从而产生胃黏膜及机体的损害.为此,笔者进一步研究HP产毒菌株CagA、 VacA 与慢性胃病关系,从而为预防和减少多种慢性胃病乃至胃癌的发生,具有重要临床意义.
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幽门螺杆菌VacA重组蛋白表达、纯化及鉴定
目的研究幽门螺杆菌空泡毒素(VacA)编码基因在大肠埃希菌中的表达及纯化重组蛋白的抗原性.方法将PET32a-vacA-E.coli BL21(DE3)工程菌株常规培养,碱裂解法小量提取重组质粒DNA,琼脂糖凝胶电泳进行酶切鉴定,基因测序法进行插入基因序列分析.重组蛋白采用IPTG诱导表达,镍亲和层析原理提纯,ELISA法检测其抗原性.结果经酶切鉴定表明,插入的基因片段全长约2 240 bp,测序分析及与Genebank比较,可以肯定插入片段为vacA基因,ELISA法检测重组蛋白具有良好的抗原性.结论 VacA重组蛋白在大肠埃希菌中成功表达,重组蛋白具有良好的抗原性.
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幽门螺杆菌基因分型与胃病关系研究进展
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)已被国际癌症组织确认为胃部疾病主要的致病因子.近年来对于Hp菌株的基因分型、流行病学和致病性等方面的研究逐步深入,越来越多的研究成果证实对Up基因分型进行细化可为精准医疗提供依据.Hp可依照CagA羧基末端磷酸化位点、VacA信号区(s)中间区(m)过渡区(i)缺失区(d)和粘附因子(OMPs)进行基因分型.Up基因型差异可导致不同毒性作用,从而引起不同临床结果和疗效预后.因此对Up基因分型可为胃病的防治提供重要依据.本文就Up基因分型方法、基因分型及其与胃部疾病研究进展进行如下综述.
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幽门螺杆菌空泡毒素受体的研究进展
空泡变性细胞毒素(VacA)是幽门螺杆菌(Hp)的主要毒力因子,VacA受体的研究成为近年来Hp致病机制研究的新热点.本文综述了初步确认的VacA受体(RPTPβ)的特性及其可能的作用机制.
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上海地区幽门螺杆菌菌株iceA、babA2基因型与临床的关系
目的检测上海地区幽门螺杆菌(Hp)感染患者中Hp菌株iceA、babA2的分布特征,探讨与Hp临床感染结局相关的菌株基因型.方法141株Hp菌株分离自43例慢性胃炎(CG)、47例十二指肠球部溃疡(DU)、30例胃溃疡(GU)和21例非贲门部胃癌患者的胃镜活检标本.采用PCR方法检测Hp菌株的iceA、babA2、cagA和vacA基因型.结果141株Hp菌株中,iceA1、iceA2和babA2的总检出率分别为74.5%(105/141)、15.6%(22/141)和63.8%(90/141),其中2例(1.4%)为iceA1、iceA2均阳性,16例(11.3%)为iceA1、iceA2均阴性.DU组的babA2检出率显著高于GU组(74.5%比50.0%,P=0.028),DU组的cagA+/babA2+检出率亦显著高于GU组(70.2%比46.7%,P=0.039).其余疾病组之间的babA2检出率差异无显著性.未发现不同临床疾病与iceA基因型的相关性.结论上海地区Hp感染者的菌株基因型主要是iceA1+/babA2+,babA2在DU和GU的发病机制中起不同作用.未发现iceA亚型与Hp临床感染结局有相关性.
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蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂对VacA空泡活性的影响
目的幽门螺杆菌(Hp)的空泡毒素(VacA)受体属于与细胞信号转导密切相关的受体蛋白酪氨酸磷酸酶家族(RPTP),但VacA导致空泡形成的具体机制尚不清楚.研究干扰信号转导后空泡形成的变化,可为临床治疗有毒Hp菌株感染提供新思路.方法采用Hp液体培养上清浓缩液作为粗制VacA毒素,将蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂(PTPI)及蛋白酪氨酸激酶抑制剂(PTKI)木黄酮倍比稀释后,与VacA共同作用于胃癌细胞,观察VacA空泡毒性的变化.结果PTPI浓度达到2.7μmol/L时,即产生对VacA空泡活性显著的抑制作用(A550=0.46±0.06比0.59±0.04,P＜0.05),至21.5 μmol/L时抑制作用可达100%(A550=0.09±0.02).PTPI浓度高于21.5 μmol/L时可见部分细胞死亡.将PTPI作用于已产生空泡的细胞,采用能引起空泡抑制作用的4个浓度梯度21.5、10.8、5.4及2.7 μmol/L,24h后PTPI组与空白对照相比,A550无显著差异.16～500 μmol/L浓度木黄酮均未对空泡活性产生明显的影响.结论PTPI对VacA空泡活性具有显著的抑制作用,间接证实VacA受体的属性为受体RPTP,VacA毒素的作用可能与干扰细胞内的信号转导过程有关.
关键词： 幽门螺杆菌 蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂 VacA -
幽门螺杆菌vacA 基因表型与体外空泡毒性的关系
目的:研究不同vacA 基因表型的幽门螺杆菌(HP)对HeLa细胞、RK-13细胞、SGC-7901细胞的空泡毒性作用.方法:分离培养30株临床胃粘膜标本中的HP菌株,抽提其总RNA和浓缩含空泡毒素(VacA)的培养上清,应用RT-PCR方法分析vacA 基因表型,应用体外细胞空泡毒性试验观察其空泡毒性作用.结果:全部菌株的信号序列均为s1a;vacA基因中区表型为m1型3株(10%),m2型27株(90%).m1型菌株对3种细胞均有空泡毒作用,m2型对HeLa细胞无空泡毒作用,但其中20株(74%)对RK-13细胞、SGC7901细胞株有空泡毒作用.结论:HP菌株vacA 基因m区是与靶细胞结合的亚单位,不同m型菌株对同一种细胞产生不同的空泡毒性作用,表明靶细胞膜上可能存在不同的受体.
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幽门螺杆菌VacA毒性亚单位在大肠杆菌中的分别表达
目的用基因工程方法获取幽门螺杆菌vacA基因毒性相关片段p37和p58,以深入研究VacA的致病机制.方法用PCR技术,扩增幽门螺杆菌vacA基因的两个片段p37、p58,并克隆入原核表达载体pQE-31,构建重组质粒pQE31-p37和pQE31-p58,转化大肠埃希菌M15,IPTG诱导蛋白质表达,用Ni-NTA柱纯化融合蛋白.结果 SDS-PAGE分析显示,经IPTG诱导的E.coli M15表达出相对分子量分别为37kDa和58kDa的P37和P58融合蛋白质,SDS-PAGE分析表明,表达的蛋白质经含Ni-NTA的层析柱纯化后为单一蛋白质.结论成功构建了原核表达载体pQE31-p37和pQE31-p58,获得了高纯度的单一蛋白质,为进一步探讨VacA的生物学活性及VacA抗体的制备鉴定了基础.
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1191名城乡居民幽门螺杆菌抗体谱检测分析
幽门螺杆菌( Helicobacter pybri,Hp)是一种微需氧的革兰阴性杆菌,主要存在于胃黏膜层,是胃炎、胃溃疡等疾病的致病菌.1994年被WHO列为胃癌第一类致癌因子幽门螺杆菌感染在不同国家或地区人群中的检出率有很大的差别[1-3],我国是Hp高感染国家,各地区人群Hp感染情况亦各不相同.本文对绍兴地区城乡居民的Hp抗体谱( Ure、CagA、VacA)检测,探讨Hp感染的地区性差异,报道如下.
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不同幽门螺杆菌培养滤液对胃上皮细胞端粒酶活性的影响
目的分析不同幽门螺杆菌(H.pylori)培养滤液对胃上皮细胞端粒酶活性的影响.方法分别以来自胃癌患者和来自慢性浅表性胃炎患者的cagA+ vacA s1a/m2和来自慢性浅表性胃炎患者的cagA+ vacA s1b/m2、cagA- vacA s1a/m2的H.pylori培养滤液与胃上皮细胞共孵育,然后撤除刺激物继续培养,观察不同时间的DNA合成速率和端粒酶活性.结果 cagA+ vacA s1a/m2和cagA+ vacA s1b/m2 Hp培养滤液与胃上皮细胞共孵育6h,诱导了胃上皮细胞端粒酶活性表达上调,DNA合成速率增加,cagA+ vacA s1a/m2的作用明显强于cagA+ vacA s1b/m2,撤除刺激物继续培养24h后,其改变得以逆转;cagA- vacA s1a/m2 H.pylori培养滤液与胃上皮细胞共孵育,其端粒酶活性和DNA合成速率无明显改变.结论不同H.pylori培养滤液对胃上皮细胞端粒酶活性的影响各异,cagA+ vacA s1a/m2 Hp的毒性产物显著地诱导了胃上皮细胞端粒酶活性表达上调.
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Hp感染隆起糜烂性胃炎脾胃湿热证与CagA、VacA的相关性研究
隆起糜烂性胃炎(raised erosive gastnitis,REG)[1-2]是指胃黏膜表面以很多结节状痘疹状突起为特征的一种慢性糜烂性胃炎,又称疣状胃炎、痘疹样胃炎、章鱼吸盘状胃炎等,好发于胃窦部,其次为胃角、胃体等,可排列成串,发病率从2.07%～16.4%不等[3].本课题组观察EagA、VacA表达在Hp感染隆起糜烂性胃炎脾胃湿热证、脾虚证之间是否有区别,以求进一步探讨脾胃湿热证在病理组织学和分子生物学水平上的特性,以期更好地协助指导中医药防治隆起糜烂性胃炎.
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幽门螺杆菌vacA基因分型和cagA基因检测
[目的]建立检测幽门螺杆菌(Hp)的cagA、vacA基因及其基因型的方法,观察vacA基因型与cagA状态的相关性.[方法]应用聚合酶链反应(PCR)对172份Hp阳性标本进行Hp cagA和vacA基因检测及其基因型分析.[结果]172份Hp阳性标本中,vacA阳性数172(100%),cagA阳性数93(54.07%);49例萎缩性胃炎患者中,cagA阳性菌株感染47例(95.92%),64例浅表性胃炎患者中,vacA阳性菌株感染28例(43.75%),两者有显著差异(p＜0.05);vacA中间区域型m1和m2分别为80和92例,两者无明显差异(p＞0.05),信号序列型sla、slb、s2分别为82、68、22例,sla与slb无明显差异(P＞0.05),sla、slb、sl(sla+slb)均显著多于s2型(p＜0.05).检出所有的6种信号序列/中间区域组合型,slb/ml和sla/m2分别为48和52例,明显多于其它基因型(p＜0.05),s2/ml仅为2列,明显少于其它基因型(p＜0.01).对Hp vacA基因型与cagA状态相关性分析,s1/m1、s1/m2、s2/m1、s2/m2型的cagA阳性数为分别为45、48、0、0,93份cagA阳性标本均为s1(s1/m1+s1/m2).[结论]vacA基因存在于所有Hp中,而cagA基因仅存在于50%～60%的Hp中,vacA s1型与cagA密切相关,cagA阳性菌株感染与萎缩性胃炎十分相关.因此,对Hp cagA基因和vacA基因型的检测,有助于加深对Hp致病机理的认识,为Hp的分型和Hp感染患者的治疗提供有力的帮助.
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洛阳地区幽门螺杆菌VacA基因及亚型临床分布特征及其与胃肠疾病关系
目的 探讨洛阳地区感染的幽门螺杆菌(H.pytori)菌株的空泡毒素基因(vacuolating cytotoxin gene,VacA)及其亚型的临床分布特征,找出该地区VacA优势基因型并探讨其与胃肠疾病的关系.方法 收集14C尿素呼气试验检测阳性,胃镜及病理诊断为慢性胃炎、消化性溃疡、十二指肠球炎、胃癌、胃息肉、反流性食管炎、其他等546例患者(男294例,女252例,年龄10～79岁),采用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测VacA.再将VacA检测阳性者进一步检测VacA亚型:VacA-S1a、VacA-S1b、VacA-S2、VacA-M1、VacA-M2,并进行统计学处理.结果 洛阳地区546例H.pylori感染患者中,VacA的总阳性率为48.35％,市区内VacA的阳性率为40.00％,市区外县VacA的阳性率为50.70％,三者相比差异无统计学意义(P＞0.05).VacA亚型S1a、S1b、S2、M1、M2的阳性率分别为76.52％、20.45％、0.76％、21.97％、72.24％,S2很少见.VacA基因亚型嵌合体S1a/M1、S1 a/M2、S1b/M1、S1b/M2的阳性率分别为12.88％、47.73％、3.79％、12.88％,未发现S2嵌合体.S区未分型6例,M区未分型10例.VacA亚型及亚型嵌合体在不同胃肠疾病之间分布差异无统计学意义(P＞0.05).结论 洛阳地区感染H.pylori菌株的VacA的阳性率为48.35％;优势基因亚型为S1a/M2;VacA亚型及亚型嵌合体在不同胃肠疾病之间分布差异无统计学意义.
