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IL-18BP-Fc-IL-1Ra嵌合蛋白对小鼠鼠尾鳞片表皮颗粒层形成的影响
目的:观察IL-18BP-Fc-IL-1Ra嵌合蛋白对小鼠鼠尾鳞片表皮颗粒层形成的影响并探讨潜在的机制.方法:腹腔分别注射IL-18BP-Fc-IL-1Ra嵌合蛋白高、中、低剂量以及甲氨喋呤,观察并比较药物对小鼠鼠尾鳞片表皮颗粒层形成的影响,监测小鼠体重并检测血清中IFN-γ含量的变化,统计有颗粒层的鳞片数.结果:IL-18BP-Fc-IL-1Ra剂量依赖性的增加有颗粒层的鳞片数,并使血清中IFN-γ含量降低.结论:IL-18BP-Fc-IL-1Ra嵌合蛋白能够促进鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成而且可能是通过降低血清内IFN-γ的含量实现的.
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地高辛标记探针检测重组白细胞抑制因子-水蛭肽嵌合蛋白宿主DNA残留量的研究
重组白细胞抑制因子-水蛭肽嵌合蛋白（ recombinant neutrphil inhibitory factor and hirulog hybrid，TNHH）是一种通过基因工程技术改造的新型嵌合蛋白，临床上可用于急性脑栓塞后的脑组织损伤修复，减少脑水肿，防止微小血栓形成从而改善微循环，是一种有前景的心脑血管疾病治疗创新药物，目前已进入临床 I、II 期研究[1-2]。由于在生产过程中使用了工程菌大肠杆菌，而宿主菌的残留 DNA 是重组药物中特有的潜在致癌性杂质，可能会随药物一同进入人体终致癌，因此对 TNHH 原液中外源性 DNA 残留量的检测极为重要[3]。
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戊型肝炎病毒嵌合重组蛋白的表达及免疫原性研究
我国是戊型肝炎主要流行区之一,人群感染率达17.2%,且呈上升趋势.由于缺乏有效的病毒体外长期培养系统,阻碍了戊型肝炎病毒(HEV)疫苗的研制和诊断试剂的开发.用基因工程手段表达HEV主要结构蛋白已成为研究的热点.本文报道用原核表达系统表达含HEV主要抗原表位的ORF2和ORF3的嵌合蛋白,并对其免疫原性进行研究.
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FasL嵌合蛋白修饰的供者脾脏细胞输注诱导移植免疫耐受的动物研究
目的 探讨FasL嵌合蛋白修饰的供者脾脏细胞输注诱导移植免疫耐受的可行性.方法 采用ProtEx~(TM)源蛋白修饰技术,将FasL嵌合蛋白修饰供者WF大鼠的脾脏细胞,在围手术期分次输注给受者ACI大鼠.施行大鼠异位心脏移植术,按注射细胞的不同处理将实验动物随机分为3组:(1)SA-FasL修饰的供者脾脏细胞组(SA-FasL组,n=23);(2)链霉亲和素蛋白(SA)修饰的供者脾脏细胞对照组(n=20);(3)未修饰的供者脾脏细胞对照组(n=8).围手术期未作任何细胞治疗为空白对照组(n=10).将耐受大鼠脾脏细胞输注给未处理ACI大鼠再行心脏移植.进行混合淋巴细胞反应;将第三方F344大鼠心脏移植给耐受大鼠,观察排斥反应.结果 SA-FasL组移植心脏长期存活率为70%,显著高于其他组(P<0.05).耐受大鼠的脾脏细胞输注能够过继转移免疫耐受;混合淋巴细胞反应与第三方移植后的排斥反应表明形成了供者特异性免疫耐受.结论 FasL嵌合蛋白修饰的供者脾脏细胞输注能够诱导供者特异的免疫耐受,这一简便高效的方法具有潜在的临床应用价值.
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烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1对多巴胺能细胞系帕金森病细胞模型的保护作用
帕金森病又称震颤麻痹，主要病理改变为中脑黑质致密部多巴胺能神经元选择性死亡［1］，从而导致基底神经节功能紊乱。该病好发于中老年人，65岁以上人群帕金森病患病率为1％～2％［2］。轴索损伤和细胞凋亡是帕金森病患者重要的病理生理学特征。现在越来越多的研究表明轴索变性在神经退行性疾病中起着重要作用，一项通过对慢华勒变性（Wlds）基因变异小鼠进行的研究［3］结果提示，轴索损伤是一个主动过程，而其早于神经元细胞的凋亡［4］，这将有可能成为治疗帕金森病的一个重要突破口。 Wlds蛋白是一种嵌合蛋白，它由N-端泛素化因子E4 b在内的70个氨基酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ NAD）合成酶烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1（ NMNAT1）的全部序列组成［5］，现已证明后者单独存在即可很大程度地延缓轴索损伤［6］，但目前针对帕金森病细胞模型是否有保护作用所进行的研究甚少，其具体机制也尚不明确。因此，我们利用质粒转染技术调节NMNAT1的表达，观察细胞轴索长度、超氧化物歧化酶1（ SOD1）及天冬氨酸特异性蛋白酶3（caspase3）表达的变化，探讨NMNAT1对帕金森病细胞模型的保护作用，从而为帕金森病的神经保护治疗提供理论依据。
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HIV-1Gag-gp120嵌合基因在重组杆状病毒系统中的嵌合表达
将中国株HIV-1 B亚型 gag 基因序列克隆到杆状病毒表达载体 pFASTBAC1中,将gp120 基因以相同的读框克隆到gag 基因的3/ 端下游,构建了重组表达质粒 pFge,利用大肠杆菌埃希菌杆状病毒表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞sf 9中表达了HIV-1的 Gag-gp120嵌合蛋白.
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融合蛋白DT389-hIL-13的克隆表达及其抗胶质瘤作用的初步研究
目的构建白喉毒素N端389个氨基酸(DT389)与人白细胞介素13(hIL-13)的融合蛋白DT389-hIL-13,并检测其生物学活性.方法通过聚合酶链反应(PCR)扩增得到hIL-13的cDNA,将序列正确的hIL-13及DT389的cDNA片段串联插入表达载体pET30a,构建表达质粒pET30a/DT389-hIL-13,并对表达产物进行鉴定及初步纯化.该融合蛋白加入培养的U251胶质细胞中,应用MTS方法检测其对多型性胶质母细胞瘤细胞的杀伤作用.结果得到序列正确的融合蛋白DT389-hIL-13的表达质粒pET30a/DT389-hIL-13,该质粒在大肠杆菌成功表达,经初步纯化后,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳及Western 印迹分析表明,该融合蛋白对白喉毒素多克隆抗体及hIL-13多克隆抗体都有很好的免疫反应性,相对分子质量约为55 000;进一步活性检测发现,该融合蛋白对多型性胶质母细胞瘤细胞系U251的生长有较强的抑制作用,且作用存在剂量相关性,其半数抑制浓度(IC50)约为5×10-11mol/L.结论成功构建了融合蛋白DT389-hIL-13的表达质粒,在细胞水平对表达产物进行了初步的活性检测,为进一步研制特异性的抗胶质瘤药物打下了基础.
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尤文肉瘤EWS-FLI1融合蛋白B淋巴细胞表位的预测及鉴定
目的:预测及鉴定尤文肉瘤EWS-FLI1融合蛋白的B淋巴细胞表位.方法:采用综合法预测EWS-FLI1蛋白的二级结构及B淋巴细胞表位,运用标准Fmoc方案合成预测的表位肽,HPLC和MS进行表位肽的纯度分析及分子量鉴定,ELISA法检测表位肽的抗原性,并测定表位肽特异性免疫血清效价,Western blot鉴定免疫血清与EWS-FLI1蛋白亲合力.结果:通过综合法预测得到3个高分值的B淋巴细胞表位,HPLC分析合成的表位肽纯度>85%,MS鉴定表位肽的分子量无误,ELISA法检测证实3个B淋巴细胞表位肽均可获得强的抗原抗体反应,其中表位肽P2的抗原性强,在1∶40时A450=2.46,达到高,1∶10 240稀释后抗原抗体反应仍呈阳性;用这3个B淋巴细胞表位肽免疫新西兰兔也能获得理想的抗体效价,其中表位肽P2获得的抗体效价高,1∶512 000稀释时A450=1.11;Western blot鉴定表位肽P1、P2免疫血清能够结合EWS-FLI1蛋白.结论:尤文肉瘤EWS-FLI1蛋白的B淋巴细胞表位肽P1、P2具有潜在的抗原性和免疫原性.
关键词： 尤文肉瘤 EWS-FLI1蛋白 融合蛋白 嵌合蛋白 B淋巴细胞表位 -
腺病毒抗原表位嵌合蛋白的原核表达及其免疫原性
目的 设计含有人腺病毒(human adenovirus,HAdV)3、7、11、14及55型抗原表位的嵌合蛋白,利用大肠埃希菌进行原核表达,并检测其抗原性及免疫原性.方法 对5种型别HAdV的六邻体蛋白氨基酸序列进行分析,筛选出其中具有强抗原性的片段,片段之间用2个甘氨酸和1个丝氨酸进行连接,形成1个多抗原片段串联的嵌合蛋白.优化嵌合蛋白的基因序列并化学合成全长基因,克隆至原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),筛选高表达嵌合蛋白的工程菌.用High Affinity Ni-NTA resin纯化该嵌合蛋白,并将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备抗血清,间接ELISA法检测嵌合蛋白的抗原性及免疫原性.结果 成功构建了高表达嵌合蛋白的工程菌,表达的嵌合蛋白相对分子质量约55 000,表达量达95％;破菌上清中嵌合蛋白的纯度较高,纯化后纯度在90％以上.嵌合蛋白免疫小鼠4次后,小鼠抗血清效价达1∶320 000.制备的腺病毒抗原表位嵌合蛋白能有效检测血清中腺病毒3、7、1 1、14及55型抗体,且能有效刺激机体产生针对各型别腺病毒抗原表位的抗体.结论 表达制备的包含5种型别HAdV抗原表位的嵌合蛋白具有较好的抗原性及免疫原性,为进一步研制腺病毒疫苗、单克隆抗体及诊断试剂奠定了基础.
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HPV16 MuE6/E7嵌合蛋白的原核表达、纯化及其免疫效果
目的 表达HPV16型MuE6/E7嵌合蛋白,并检测其免疫原性及抗肿瘤活性.方法 将构建的重组MuE6/E7蛋白的表达载体转化大肠杆菌BL21(λDE3)进行诱导表达,表达的包涵体蛋白经分离、纯化、变性及复性后,通过离子交换和分子筛层析进行纯化.纯化蛋白经SDS-PAGE、Western blot、HPLC和质谱分析鉴定,并免疫C57BL/6小鼠,检测其免疫原性和抗肿瘤活性.结果 重组 MuE6/E7蛋白相对分子质量约为21000,表达量约为23.06%,表达形式为包涵体,经复性、纯化后,纯度达97.17%.免疫3针后,小鼠可产生高滴度的HPV特异性抗体,并且与注射剂量呈正相关.免疫小鼠能抵抗,TC-1肿瘤细胞的攻击,并可延长TC-1致瘤小鼠的存活期.结论 已表达并纯化了重组MuE6/E7蛋白,其对TC-1致瘤小鼠具有一定的免疫治疗作用,为进一步研制HPV治疗性疫苗奠定了基础.
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嵌合蛋白sTNFRⅡ-IgG Fc纯化与生物学活性研究
目的建立嵌合蛋白sTNFR-IgG Fc的纯化工艺,并对该蛋白的理化和生物活性进行研究.方法 嵌合蛋白sTNFR Ⅱ-IgG fc经变性、复性后,用金属螯合层析进行纯化,纯化的蛋白进行配基结合实验和拮抗TNF活性检测.结果该嵌合蛋白的纯度大于95%,在体外能够二聚化,保留了sTNFRⅡ对hTNFα的结合特性,同单体sTNFRⅡ相比,对hTNFα的拮抗活性明显提高.结论为进一步研究奠定了基础.
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HBV核心颗粒作为B细胞/T细胞表位的载体
重组乙型肝炎病毒(HBV)核心(HBc)这个20面体病毒样颗粒(VLP)可被视为外来免疫表位的非感染性载体的基本类型。重组HBc颗粒用于展示多种病毒、细菌和原虫蛋白的免疫显性表位。HBc颗粒作为载体的实际运用性是由其在异源性表达系统中高水平的合成和正确的自身装配能力来实现的。HBc壳膜二聚体单位不寻常的。螺旋结构，选择包装成为T=3和T=4对称的二十面体，并存在长而突出的刺突。这些发现增强了人们对HBc VLP的兴趣。特别是刺突的顶端似乎是展示长达236个氨基酸残基的外来序列的佳靶位。大量关于表位展示的实验室数据与精确的结构信息相结合，有可能设计出以HBc颗粒为基础的诊断、疫苗和基因治疗工具。
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英夫利西单抗Ⅲ期临床试验中一例严重不良反应的急救与护理
英夫利西单抗(重组抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体,infliximab)是治疗类风湿性关节炎的新型生物制剂药物,该药物是一种人属嵌合蛋白,可能出现的不良反应有发热、寒战、乏力、荨麻疹、呼吸困难、低血压等,大多出现在输液过程中或者输液后1～2 h,严重时可因输液反应停止输注;有些患者会发生迟发性过敏反应,常见于用药后数天到数周,表现为发热、关节痛、肌痛、皮疹和白细胞增多等,约0.5%的患者可以出现严重输液反应.
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2001年中国中西医结合皮肤性病学术会议论文综述
2001年中国中西医结合皮肤性病学术会议,收到来自全国各地的文章500余篇.其中有关银屑病的论文185篇,感染性皮肤病132篇,非感染性皮肤病209篇.内容详尽、丰富,包括基础研究、临床观察、中西药物内服外用治疗经验、流行病学统计、误诊分析、个案报道等.反映了我国中西医结合研究和治疗皮肤病已越来越受到重视,水平正在不断提高和发展,部分已接近国际水平,上了一个新台阶.现从以下三方面进行综述.1 银屑病银屑病与细胞因子的关系研究较多.在银屑病皮损中,IL-1α、TNF-α、IL-2、IL6、IFN-v、IL-12增多,IL-15及IL-15结合活性增高,IL-8和IL-8受体增多,表皮生长因子受体(EGF)及其配体TGF-α和amphiregulin的表达均增高,IL10及其受体表达下降.银屑病血清中IL6增多.鳞屑和皮损吸疱液中,GM-CSF增多.然而,银屑病的发病不单单与个别细胞因子有关,主要是网络作用.由于角质形成细胞(KC)和皮肤浸润的T细胞可视为银屑病的主角,他们产生的各种细胞因子会形成一个特殊的网络.鉴于上述理论,提出了银屑病治疗对策:补充Th2或抗炎细胞因子;抑制或阻断促炎症细胞因子.CTLA4Ig是采用基因重组法构建的一种可溶性嵌合蛋白,可以下调Th1类细胞因子,上调Th2类细胞因子,因此,可以用CTLA4Ig治疗银屑病.
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RNA结合域决定JDV Tat具有较强的激活能力
为分析JDV与BIV、HIV-1 LTR和Tat相互激活能力差异的原因,在氨基酸序列对比及HIV-1 Tat功能域划分的基础上构建了JH、HJ、JB、BJ几种嵌合Tat蛋白,并克隆到真核表达载体.将上述表达质粒与以JDV、BIV和HIV-1 LTR为启动子,以luc为报告基因的质粒共转染Hela细胞,证实了三种不同Tat激活能力的差异主要来自其结合域RNA结合能力的差异,排除了结构域不完整和细胞因子缺乏造成JH不激活HIV-1 LTR的可能性.
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嵌合抗菌肽的研究
嵌合蛋白(Chimeric protein)是20世纪90年代发展起来的一种基因工程技术,通过PCR拼接技术,将2个或以上生物活性蛋白或其功能结构域编码基因偶联起来,以产生新的生物活性蛋白.比如CD4免疫粘附素.
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人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答
探索人β防御素2(hBD-2)和前列腺特异性膜抗原(PS-MA)共表达重组核酸疫苗对前列腺癌的免疫治疗.研究以pcDNA3.1为载体,构建重组质粒pcDNA3.1/PSMA和pcDNA3.1/hBD-2-PSMA,通过RT-PCR和免疫组化检测其表达.并免疫小鼠,进行血清中抗体检测,CD4+、CD8+T淋巴细胞数目测定及CTL特异性杀伤作用检测.结果显示构建的质粒转染COS-7细胞后能表达目的基因,免疫小鼠后能在体内持久表达,可以诱导产生特异性抗体,能有效的刺激T细胞增生,诱导特异性CTL反应.当以hBD-2作为免疫佐剂时,CTL活性增强.本研究成功的构建了含PSMA的表达质粒,免疫小鼠可以诱导出有效的体液和细胞免疫,为前列腺癌的免疫治疗奠定了一定的实验基础.
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嵌合鞭毛蛋白fliC/esat佐剂效应的研究
目的:研究嵌合形式表达的鞭毛蛋白对结核分枝杆菌(MTB)抗原ESAT-6的免疫佐剂效应.方法:用PCR方法扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因fliC1及MTB抗原ESAT-6编码序列,通过重叠PCR将ESAT-6编码序列插入fliC1的高变区域,构建嵌合鞭毛基因片段fliC/esat.将fliC/esat片段分别插入原核表达载体pET,构建pET-fliC/esat质粒.将ESAT-6编码序列插入原核表达载体pBCX的多克隆位点,构建原核表达质粒pBCX-esat.以质粒pET-fliC/esat及pBCX-esat分别转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基1-1硫代-β呋喃半乳糖苷诱导融合的嵌合蛋白fliC/esat及ESAT-6蛋白的表达.以抗ESAT-6 mAb HYB 076-08为一抗,通过Western blot鉴定嵌合蛋白fliC/esat及ESAT-6蛋白.以两种蛋白分别在体外刺激骨髓树突状细胞(BMDCs),通过FACS分析共刺激分子CD40、CD80、CD86和CD54的表达,同时用ELISA检测前炎性因子IL-12p70表达的水平.此外,以两种蛋白分别免疫C57BL/6小鼠,运用ELISPOT法分析ESAT-6特异的IFN-γ及IL-4分泌细胞的产生.结果:嵌合蛋白及ESAT-6蛋白均可溶性表达.相对分子质量(Mr)约为64000和39 000.Western blot的结果显示,fliC/esat嵌合蛋白及ESAT-6蛋白均具有良好的反应原性.与ESAT-6蛋白相比较,fliC/esat嵌合蛋白在体外能诱导BMDCs成熟.IL-12p70的检测结果显示,fliC/esat嵌合蛋白诱导BMDCs分泌的IL-12p70明显高于ESAT-6蛋白诱导分泌的IL-12p70(P<0.01).体内实验结果表明,嵌合鞭毛蛋白免疫组能够显著增强ESAT-6特异性免疫应答,且免疫应答趋于Th1型.结论:鞭毛嵌合表达ESAT-6抗原,能够有效地上调BMDCs共刺激分子表达,增强ESAT-6特异性细胞的免疫应答,以嵌合形式表达的鞭毛蛋白对ESAT-6抗原具有诱导Th1型免疫应答的佐剂效应.
