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嵌合鞭毛蛋白fliC/esat佐剂效应的研究
目的:研究嵌合形式表达的鞭毛蛋白对结核分枝杆菌(MTB)抗原ESAT-6的免疫佐剂效应.方法:用PCR方法扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因fliC1及MTB抗原ESAT-6编码序列,通过重叠PCR将ESAT-6编码序列插入fliC1的高变区域,构建嵌合鞭毛基因片段fliC/esat.将fliC/esat片段分别插入原核表达载体pET,构建pET-fliC/esat质粒.将ESAT-6编码序列插入原核表达载体pBCX的多克隆位点,构建原核表达质粒pBCX-esat.以质粒pET-fliC/esat及pBCX-esat分别转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基1-1硫代-β呋喃半乳糖苷诱导融合的嵌合蛋白fliC/esat及ESAT-6蛋白的表达.以抗ESAT-6 mAb HYB 076-08为一抗,通过Western blot鉴定嵌合蛋白fliC/esat及ESAT-6蛋白.以两种蛋白分别在体外刺激骨髓树突状细胞(BMDCs),通过FACS分析共刺激分子CD40、CD80、CD86和CD54的表达,同时用ELISA检测前炎性因子IL-12p70表达的水平.此外,以两种蛋白分别免疫C57BL/6小鼠,运用ELISPOT法分析ESAT-6特异的IFN-γ及IL-4分泌细胞的产生.结果:嵌合蛋白及ESAT-6蛋白均可溶性表达.相对分子质量(Mr)约为64000和39 000.Western blot的结果显示,fliC/esat嵌合蛋白及ESAT-6蛋白均具有良好的反应原性.与ESAT-6蛋白相比较,fliC/esat嵌合蛋白在体外能诱导BMDCs成熟.IL-12p70的检测结果显示,fliC/esat嵌合蛋白诱导BMDCs分泌的IL-12p70明显高于ESAT-6蛋白诱导分泌的IL-12p70(P<0.01).体内实验结果表明,嵌合鞭毛蛋白免疫组能够显著增强ESAT-6特异性免疫应答,且免疫应答趋于Th1型.结论:鞭毛嵌合表达ESAT-6抗原,能够有效地上调BMDCs共刺激分子表达,增强ESAT-6特异性细胞的免疫应答,以嵌合形式表达的鞭毛蛋白对ESAT-6抗原具有诱导Th1型免疫应答的佐剂效应.
