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人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位重组蛋白纯化及免疫活性研究
热休克蛋白(heat shook protein,Hsp)为幽门螺杆菌(Hp)共同的抗原成分,分为A(HspA)、B(HspB)两个亚单位.目前,通过细菌培养获得大量Hp,并从中纯化出足量的亚单位抗原非常困难.因此,我们采用基因工程技术构建重组HspA基因工程菌,并对HspA重组蛋白纯化条件及免疫学活性进行研究.
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工程菌发酵培养浅析
利用微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物是目前工业化生产基因工程药物的主要方法.工程菌发酵培养主要包括育种技术、发酵过程的优化等.其中良好的生产菌种是发酵工作的中心环节.在传统的发酵工业中,菌种的诱变和筛选工作起着非常重要的作用.在七·五期间,国家发展高技术产业确定后,基因工程技术(重组DNA技术)为发酵工程开辟了广阔的领域.生物技术产品作为优先开发的领域之一,给我国生命科学领域带来了一场深刻的革命,科学家们利用基因操作技术克隆出目的基因,然后将其组装入表达质粒,转染到宿主细胞中,经过发酵诱导表达目的产物以及纯化等一系列程序生产出所需要的目的产物.特别是医疗用蛋白、多肽类治疗药物的研制和开发在全国已蓬勃兴起,时至今日,已有多种蛋白、多肽类药物研制成功并应用于临床.诸如重组大肠杆菌表达生产人干扰素,白细胞介素和人生长激素以及集落刺激因子等.然而要实现基因工程工业化生产,除了要构建高效的载体-宿主系统外,基因工程菌的发酵过程控制也是十分重要的.
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工程菌DH5α/pCW-PL-XE-TNFαm2的遗传稳定性
目的 本基因工程大肠杆菌DH5α/pCW-PL-XE-TNFαm2所表达的靶向融合蛋白XE-TNFαm2已被初步证明具有用于清除艾滋病患者体内HIV病毒的前景.其目的蛋白表达水平为32％ ～ 36％细胞总蛋白.本研究旨在验证其遗传稳定性.方法 工程菌株DH5α/pCW-PL-XE-TNFαm分别在LBAmp+与LBAmp-二种固体培养基上逐日单菌落划线传代,32℃培养过夜.每间隔十代运用一般温控表达技术,确定其XE-TNFαm2的蛋白含量,后比较分析各代之间目的蛋白(20.3 kDa)表达水平的差异情况.结果 该重组基因工程菌连续传100代后XE-TNFαm2的蛋白表达水平没有明显差异(P＞0.05)；只是在上述两种情况下传至100代后将其置于4℃保藏4、5、6个月,其目的蛋白表达水平有8％的下降.本载体质粒含有的Clts857序列、PL启动子与T1T2末端终止序列,是确保目的基因稳定高表达的3个关键元件.结论 本研究结果证明该工程菌DH5α/pCW-PL-XE-TNFαm2具有良好的遗传稳定性.
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氯化消毒对基因工程大肠杆菌的灭活效果分析
目的 探索次氯酸钠对基因工程大肠杆菌的消毒规律,丰富消毒学理论.方法 分别在0.5、0.6、0.7、0.8 mg/L次氯酸钠浓度下进行基因工程E.coli HB101和野生型E.coli 25922的消毒,通过细菌计数,比较对2种细菌的杀灭率.结果 次氯酸钠的消毒剂量对基因工程大肠杆菌的杀菌率具有明显的影响.在剂量为0.5 ～ 0.8 mg/L范围内作用30 min,次氯酸钠对基因工程E.coli HB101的杀灭率比野生型E.coli 25922高0.25％ ～9.01％,用0.8 mg/L次氯酸钠消毒30 min后,E.coli HB101全部死亡,E.coli 25922的杀灭率为99.75％;用0.7 mg/L的次氯酸钠作用不同时间,消毒剂对基因工程E.coli HB101比野生型E.coli 25922的杀灭率高(0.3 ～2.2)-lg,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 消毒剂对基因工程大肠杆菌的灭活效果比对野生型大肠杆菌强.
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重组人心肌肌红蛋白基因工程菌的构建
目的 构建稳定、高效表达重组人心肌肌红蛋白(rhMb)的基因工程菌株,为临床检测早期心肌损伤及预后提供诊断试剂,促进肌红蛋白诊断标准化的研究.方法 采用RT-PCR技术从人心肌组织总RNA中克隆出全长的人心肌肌红蛋白基因,将其插入到PMD18-T simple克隆载体中,转化DH5α克隆菌株.经酶切和测序对目的基因进行分析,再插入到pET-21a(+)表达载体中,转化BL21(DE3).对诱导表达的目的蛋白行SDS-PAGE和运用锐普心肌梗死仪检测重组蛋白的抗原性并准确定量.结果 测序表明RT-PCR所得的肌红蛋白基因hMb序列与GenBank(NM 005368.2)中报道的序列一致,目的蛋白表达量达菌体总蛋白的15%,重组蛋白抗原性良好.结论 成功构建了稳定、高效表达重组人心肌肌红蛋白基因工程菌株.
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重组胶原蛋白海绵的制备及性状表征
背景:重组胶原蛋白具有良好的亲水性及生物相容性,但其存在溶解性强及机械强度不足等缺点.化学交联可显著提高材料的韧性、力学强度及耐降解性.目的:制备重组胶原蛋白海绵,并对其理化性质及安全性进行评价.方法:采用微生物发酵法获得重组胶原蛋白,经戊二醛交联后,将其置于模具中冷冻干燥,获得多孔重组胶原蛋白海绵,检测交联后重组胶原海绵的吸水率与孔隙率,采用扫描电镜观察交联前后重组胶原海绵的表面形态,红外光谱仪对比交联前后重组胶原海绵结构的变化.采用交联重组胶原海绵浸提液培养L929细胞,培养第68小时,采用MTT法检测细胞相对增殖率,评估交联重组胶原海绵的细胞毒性.结果与结论:①交联后重组胶原海绵的吸水率为(2903.83±47.90)％,平均孔隙率在85％以上;②扫描电镜显示,交联前,重组胶原海绵的孔隙呈蜂窝状,致密;交联后,重组胶原海绵的孔隙较大,呈板层结构,可看到板层间桥键连接,纵向可看到较大褶皱;③红外光谱显示,交联后的重组胶原海绵特征性化学结构特征无明显变化;④交联重组胶原海绵浸提液培养L929细胞的相对增殖率为84％,细胞毒性为1级,生物安全性良好;⑤结果表明采用戊二醛交联制备的重组胶原海绵,理化性质稳定,生物相容性良好.
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假单胞基因工程菌的开发应用现状与展望
假单胞菌(Pseudomonas)是一群革兰阴性的杆菌或球杆菌,需氧生长,多数有鞭毛有动力.按照<伯杰氏系统细菌学手册>第二版,假单胞菌科包括29个属,数百个种和亚种.假单胞菌广泛存在于自然界,是土壤和水体微生态系统的重要组成部分,也是自然界的碳、氮循环的重要组成部分[1].
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泰乐菌素基因工程菌的构建
目的 构建具有双拷贝tylF基因的泰乐菌素基因工程菌,以解决泰乐菌素基因生物合成的限速环节,提高泰乐菌素的发酵产量.方法 通过SOE-PCR获得PermE-tylF基因,构建随机整合型重组质粒pBH05,通过接合转移将PermE-tylF基因及其载体随机整合到弗氏链霉菌的基因组中,并通过抗性筛选获得重组菌株D-120.将重组菌株D-120进行摇瓶发酵,采用生物效价测定的二剂量法测定泰乐菌素的发酵单位.结果 在相同的发酵条件下,重组菌株泰乐菌素的发酵单位较出发菌株提高32.7％.结论 该基因工程菌的构建改善了泰乐菌素生物合成的限速环节,大幅度提高了泰乐菌素的发酵效价.
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发酵温度对重组工程菌生长密度和干扰素表达的影响
目的观察发酵温度对重组人干扰素α2a(IFNα2a)工程菌PBV888/DH5α生长密度和表达的影响.方法采用NBS-40L发酵罐,在发酵过程中调整培养温度,检测工程菌的生长密度和IFN表达量.结果经35℃培养至对数期,降温至30℃继续培养2～3h后升温至42℃进行诱导培养,连续实验3批次,平均生长密度A值为35.0,菌体湿重47g/L,IFN表达量为28×106IU/ml.结论确立了工程菌生长和IFN表达的适培养温度.
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他克莫司工程菌的构建及初步发酵工艺优化
基于他克莫司的生物合成途径和机制,根据生物合成基因簇序列设计引物,通过PCR扩增天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)乙酰CoA羧化酶和游动放线菌(Actinoplanes sp.)N902-109赖氨酸环化脱氨酶/非核糖体肽合成酶(rapL/rapP)基因,将其整合到筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis No.9993基因组上,成功构建了分别过表达乙酰CoA羧化酶基因和rapL/rapP基因的重组工程菌,分别命名为SIPI-F002和SIPI-F003.试验结果显示,添加0.1％丙酸钠和0.01％油酸甲酯均可以促进工程菌SIPI-F002合成他克莫司,相应摇瓶产量为392和383 μg/ml.调整发酵培养基复合碳源为4％糊精和2％可溶性淀粉,可以促进SIPI-F003发酵生产他克莫司,摇瓶产量达到694 μg/ml.
关键词： 他克莫司 乙酰CoA羧化酶基因 rapL/rap基因 基因工程菌 PCR扩增 -
产L-5-甲基四氢叶酸工程菌自动诱导培养基的优化
考察了自动诱导培养基代替异丙基-β-D-巯基半乳糖苷(IPTG)培养基诱导四氢叶酸还原酶在重组大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性,对自动诱导培养基自诱导时的乳糖浓度和葡萄糖添加量进行优化,并与IPTG诱导培养基进行比较,确定了自动诱导培养基配方:葡萄糖1.8mmol/L、乳糖3mmol/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl10g/L.HPLC结果显示,自诱导与IPTG诱导条件下的L-5-甲基四氢叶酸产量接近.
关键词： L-5-甲基四氢叶酸 基因工程菌 自动诱导培养基 -
重组人SOD工程菌发酵表达条件的优化
采用正交试验优化重组人超氧化物歧化酶工程菌的LB培养基,得到培养基佳配比(g/L):蛋白胨12,酵母膏5,葡萄糖1和氯化钠10.以此为基础优化基因工程菌发酵条件,确定培养基初始pH 6.5～7.5,装液量20％,菌体密度(D600) 0.55～1.4,42℃诱导表达2～3h,目的蛋白相对表达量由优化前的25％提高至41％,绝对表达量是优化前的2.4倍.
关键词： 重组人超氧化物歧化酶 基因工程菌 发酵 诱导 表达 -
重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因工程菌的构建
目的 构建稳定、高效表达重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)的基因工程茵株,为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料,促进cTnⅠ诊断标准化的研究.方法 采用RT-PCR方法从人心肌组织总RNA中克隆出全长的人cTnⅠ基因,将其插入到pMD19-T克隆载体中,经酶切和测序对目的基因分析,再插入到pET-21a(+)表达载体中,转化BL21(DE3),对诱导表达的目的蛋白行SDS-PAGE和采用锐普心梗仪检测重组蛋白的抗原性并准确定量.连续传代试验验证基因工程茵稳定性.结果 克隆了全长的cTnⅠ基因,目的蛋白表达量达菌体总蛋白的38%,重组蛋白抗原性良好,基因工程菌具有较高的稳定性.结论 成功构建了稳定、高效表达重组人cTnⅠ的基因工程菌.
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必特霉素基因工程菌航天育种的研究
探讨航天技术对必特霉素基因工程菌的育种效果.我国返回式搭载卫星对基因工程必特霉素菌种进行了航天育种,共搭载4个菌株以沙土、甘油、斜面等不同方式,经受航天环境条件处理后计算其孢子存活率、营养缺陷型出现率及菌株的发酵效价.在本实验条件下菌株的存活率均很低,尤其是沙土方式的致死率为100%,甘油及斜面孢子的致死率分别为99.79%～100%和99.81%～100%.营养缺陷型出现率为1.65%.存活菌株的负突变率高于正突变率.经筛选从408株正突变株获得了发酵效价提高11.3%～14.5%的菌株.航天技术有可能应用于基因工程必特霉素的育种,但适于其育种的空间条件必须经过详尽而细致的研究和控制.
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BNP基因工程菌生长密度和诱导时间对BNP蛋白表达的影响
用2L三角瓶在摇床发酵各进行了3批试验.观察不同培养时间、细菌密度和不同诱导时间对重组人脑钠肽(BNP)基因工程菌的收获量和脑钠肽(BNP)蛋白表达量的影响.工程菌于37℃培养3～3.5 h,细菌生长密度OD600在0.8～1.0之间,经IPTG诱导培养4 h,菌体的收获量和表达水平都比较理想,其湿重和表达量的均值分别可达10.3 g/L菌液和25.8%,达到了国外文献(8%～10%g/L菌液和25%左右)水平.诱导前不同的细菌密度和诱导后不同的诱导时间均能显著影响BNP基因工程菌的产量和目的蛋白表达量.
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基因工程菌固定化研究进展
根据近期文献综述了固定化细胞生物技术在基因工程菌中的应用.质粒的不稳定性对基因工程菌的培养和产物的生产有着极大的影响,将基因工程菌固定化后培养可提高基因工程菌的稳定性、生物量和克隆基因产物的产量.培养条件对固定化工程菌的培养有一定的影响.非生长的基因工程菌的固定化,可提高其半衰期并能稳定操作较长时间.
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固定化--提高基因工程菌稳定性的新策略
重组DNA技术使生物技术取得了彻底性的变革,它可以提供具有极强选择性和累积目的代谢物能力的菌株.但为了进一步降低这些代谢物的生产成本,还需建立高效的生物转化体系及优化重组菌的培养环境.近年来,这些方面的发展主要体现在固定化技术在基因工程菌的应用上.本文在前人工作的基础上将游离及固定化重组菌进行了比较,并发现了固定化重组菌高稳定性的原因.另外还讨论了诸多培养条件对基因工程菌稳定性的影响.
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基因工程菌生物合成叔亮氨酸的条件研究
研究酶法合成叔亮氨酸的反应条件.利用产亮氨酸脱氢酶基因工程菌和产甲酸脱氢酶基因工程菌进行混合全细胞生物转化反应合成叔亮氨酸,考察了诱导剂IPTG浓度、诱导温度和诱导时间等不同诱导条件对产亮氨酸脱氢酶基因工程菌和产甲酸脱氢酶基因工程菌产酶比活力的影响,确定了两种基因工程菌优化的诱导表达条件;通过单因子试验(如转化pH值、转化温度、底物浓度和菌体浓度等)来研究不同反应条件对基因工程菌催化合成叔亮氨酸的影响.结果:工程菌催化合成叔亮氨酸的适pH是9.5,适合的反应温度为30℃,且两种重组菌的反应湿重比为2∶1时,可达到高的产量.较高的底物浓度会对反应产生抑制作用,适当提高菌体浓度可以降低底物的抑制作用.通过采用底物分批流加的添加方法,得到了更好的转化效果,后可达到叔亮氨酸产量为42 mg/ml.
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低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因工程菌的构建
应用PCR技术从E.coli JM105中扩增出长约1kb的低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因,将其插入高表达载体pET 11c的NdeI/BamHI位点,转化E.coli BL 21(DE3),构建高产低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因工程菌.SDS-PAGE和薄层扫描表明,经IPTG诱导2h,工程菌低特异性L-苏氨酸醛缩酶的表达量占菌体总可溶性蛋白的72.9%.酶活测定结果表明,39株工程菌低特异性L-苏氨酸醛缩酶的活力比宿主菌均有不同程度的提高,其中86号是宿主菌的31倍.
关键词： 低特异性L-苏氨酸醛缩酶 β-羟基-α-氨基酸 基因工程菌 -
L-天冬酰胺酶Ⅱ基因工程菌的培养
为提高L-天冬酰胺酶Ⅱ基因工程菌Esch erichia coli pKA/CPU210009的产酶量,采用正交试验法确定了较佳培养条件,并优化了发酵工艺.工程菌摇瓶产酶稳定在190U/ml.25L发酵罐产酶亦高达180U/ml,发酵周期大大缩短,仅9～10h.产酶量比原工艺提高1倍以上,具有较好的工业生产前景.
