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抗肝癌人源化Diabody在大肠杆菌中的可溶性表达及活性鉴定
目的:构建人源化抗肝癌双价抗体,并实现其在大肠杆菌中的可洛性表达.方法:缩短人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的连接肽为5肽,构建(hscFv25)2基因,克隆入原核表达载体后,转化入大肠杆菌表达,并纯化目的蛋白,细胞ELISA、免疫组织化学法检测其生物活性.结果:目的基因在大肠杆菌中得到了可洛性表达,纯化蛋白的相对亲和力比亲本抗体提高了10倍左右,对肝癌组织切片的免疫组织化学染色呈强阳性,阳性率为75%.结论:成功制备了人源化抗肝癌双价抗体,该抗体具有较高的亲和力,为进一步的临床研究奠定了基础.
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工程菌发酵培养浅析
利用微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物是目前工业化生产基因工程药物的主要方法.工程菌发酵培养主要包括育种技术、发酵过程的优化等.其中良好的生产菌种是发酵工作的中心环节.在传统的发酵工业中,菌种的诱变和筛选工作起着非常重要的作用.在七·五期间,国家发展高技术产业确定后,基因工程技术(重组DNA技术)为发酵工程开辟了广阔的领域.生物技术产品作为优先开发的领域之一,给我国生命科学领域带来了一场深刻的革命,科学家们利用基因操作技术克隆出目的基因,然后将其组装入表达质粒,转染到宿主细胞中,经过发酵诱导表达目的产物以及纯化等一系列程序生产出所需要的目的产物.特别是医疗用蛋白、多肽类治疗药物的研制和开发在全国已蓬勃兴起,时至今日,已有多种蛋白、多肽类药物研制成功并应用于临床.诸如重组大肠杆菌表达生产人干扰素,白细胞介素和人生长激素以及集落刺激因子等.然而要实现基因工程工业化生产,除了要构建高效的载体-宿主系统外,基因工程菌的发酵过程控制也是十分重要的.
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TRAIL分子胞外区基因工程蛋白的制备与鉴定
目的制备人TRAIL配体胞外区基因工程蛋白.方法应用RT-PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中扩增TRAIL配体胞外区cDNA,克隆入PCR2,1载体,测序验证后用基因重组法构建了TRAIL配体胞外区和组氨酸盒的原核表达质粒pQE-hTRAIL.将重组质粒转入大肠杆菌M15中表达,经1mmol/LIPTG在37℃条件下诱导4 h,亲和层析柱纯化.用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定表达产物.结果所表达融合蛋白为人TRAIL配体胞外区分子,分子量30kD.表达量约为2mg/ml.结论人TRAIL配体胞外区在大肠杆菌中得到良好表达,为深入研究TRAIL配体分子在肿瘤与自身免疫病中的可能应用提供了材料.
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126 酵母与大肠杆菌表达的重组裂殖子表面蛋白4/5抗约氏疟原虫致死性攻击保护效果的比较
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人可溶性TRAIL基因的克隆及表达
为了利用大肠杆菌表达人可溶性肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白,应用RT-PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中扩增人可溶性TRAIL蛋白cDNA,克隆入PCR2.1载体,测序验证后用基因重组法分别构建了人可溶性TRAIL蛋白的真核与原核表达质粒载体.将重组质粒分别转入C0S-7和大肠杆菌M15中表达.用流式细胞仪检测人可溶性TRAIL蛋白在COS-7细胞中的瞬时表达,用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定大肠杆菌中的表达产物.所表达融合蛋白为人可溶性TRAIL蛋白分子,相对分子质量为21 000,表达量约为2mg/ml.所表达的人可溶性TRAIL蛋白具有诱导HL-60细胞凋亡的作用.上述结果提示大肠杆菌可良好表达具有生物活性的人可溶性TRAIL蛋白,为深入研究TRAIL分子在肿瘤与自身免疫性疾病中的可能应用提供了材料.
关键词: 人可溶性TRAIL蛋白 融合蛋白 大肠杆菌表达 -
143大肠杆菌表达的恶性疟原虫酸碱重复抗原重组片段的免疫原性
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重组干扰素诱导的跨膜蛋白表达及其对结直肠癌患者的血清学反应
干扰素诱导的跨膜蛋白1(interferon induced transmembrane protein 1,IFITM1,)是SEREX方法筛选大肠癌组织cDNA文库时获得的结肠癌相关抗原基因[1],本研究利用大肠杆菌表达系统重组IFITM1编码蛋白并研究该蛋白对结直肠癌患者血清的抗血清反应.
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重组雪花莲外源凝集素(GNA)表达条件的优化
研究了含有GNA基因的重组大肠杆菌菌株G2和G3在不同诱导培养温度、起始诱导菌体密度(OD600值)、诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度及诱导培养时间等重要因子对重组GNA表达的影响,以期获得重组GNA表达的佳条件.实验结果表明,不含信号肽的G2菌株和含有信号肽的G3菌株的佳培养条件分别为:起始诱导菌体密度为OD600≈0.6;诱导剂IPTG浓度为0.1mmol/L;诱导培养时间为6 h;G2和G3的诱导培养温度分别为37℃,28~30℃.该研究结果将为发酵生产重组GNA的工艺提供依据,也为重组GNA开发成为生物农药、试剂和免疫增强剂提供支持.
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组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase(r-PA)基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
通过PCR的方法从人t-PA基因上扩增到r-PA基因的编码序列,并克隆到pMD18-T载体中,DNA测序与文献报道完全一致.该基因被克隆到多用途表达载体pET28a中,重组表达载体r-PA/pET 28a转化E.coli BL21(DE3),培养表达,SDSPAGE分析可见M,约39 000的蛋白条带,约占细胞内总蛋白的30%以上.体外溶圈法测定活性表明该重组蛋白具有较好的纤溶活性.
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O-GlcNAc糖基转移酶在原核和真核细胞中的表达和提纯
目的:本文为进一步研究蛋白O-GlcNAc糖基化修饰提供重要资源.方法:为了探索制备纯化具有生物学活性的重组OGT的有效方法,本文用大肠杆菌和Hi5昆虫细胞表达并纯化具有活性的重组 OGT.携带人OGT cDNA的PET32a质粒在大肠杆菌中表达出带有1个S-Tag的重组人OGT融合蛋白,然后用与S-蛋白质偶联的琼脂糖凝胶颗粒从细菌裂解液中亲和纯化OGT融合蛋白.结果:其纯化的OGT在电泳中显现单一条带并具有生物活性,但其活性在洗脱后丧失.在Hi5昆虫细胞中表达的鼠肝OGT带有一His6tag,经镍离子螯合柱纯化后,其比活性达到0.88 nmol·min-1·mg-1 OGT.结论:在这两个表达系统中制备重组OGT各有利弊.
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外用重组人表皮生长因子治疗鼻出血
外用重组人表皮生长因子(rhEGF)系使用重组技术构建的大肠杆菌表达生产的,是由56个氨基酸组成的多肽,能促进创面修复,缩短创面愈合时间.我科使用外用rhEGF治疗鼻中隔Little's区出血、黏膜糜烂38例,报告如下.
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SARS冠状病毒N蛋白的表达及其诱导的免疫应答
表达和纯化SARS冠状病毒的N蛋白,分析其诱导的免疫应答.方法从重组克隆pMD18-N中切取N基因的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达N蛋白,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答.N基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌表达了SARS冠状病毒的N蛋白;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被重组N蛋白的GST融合蛋白的免疫血清识别,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体和Th1/Th2型的免疫应答.成功构建了N蛋白的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性.
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贝氏柯克斯体表面抗原基因p1与hspB的融合基因在大肠杆菌中的表达
将贝氏柯克斯体(Coxiella burneil)表面抗原P1蛋白基因与热休克蛋白B(HspB)基因片段融合,并使该融合基因在大肠杆菌细胞内表达,产生P1-HspB融合蛋白.采用PCR方法,从贝氏柯克斯体新桥株基因组DNA中扩增P1蛋白基因(p1)和HspB蛋白基因(hspB)片段,将两基因片段分别与原核表达载体pQE30连接,分别构建重组表达质粒pQE30/p1和pQE30/hspB.用BamHⅠ和SadI DNA内切酶将p1基因片段从pQE30/p1切下并与pQE30/hspB的hspB连接,构建重组质粒pQE30/p1-hspB.用IPTG诱导pQE30/p1-hspB转化的大肠杆菌表达融合基因p1-hspB.SDS-PAGE分析发现pQE30/p1-hspB转化的大肠杆菌表达一83 kDa融合蛋白;经薄层扫描分析,该融合蛋白约占到全菌体蛋白的12.1%;免疫印迹分析发现该融合蛋白能被贝氏柯克斯体感染小鼠血清所识别.构建的p1-hspB融合基因在大肠杆菌中得到了有效表达,表达的P1-HspB融合蛋白能与抗贝氏柯克斯体抗体特异反应,P1-HspB融合蛋白为Q热亚单位疫苗的研制提供了一种新型融合蛋白.
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立氏立克次体外膜蛋白B基因片段的克隆与表达
采用PCR方法,从立氏立克次体基因组中扩增长为1188bp的ompB基因片段,将该基因片段与原核表达载体pQE30连接,构建重组原核表达质粒pQE30/ompB;将pQE30/ompB转入大肠杆菌细胞内,用IPTG诱导转化大肠杆菌表达目的基因.SDS-PAGE分析发现pQE30/ompB转化菌表达了一44kDa重组蛋白,该蛋白与立氏立克次体免疫兔血清在免疫印迹分析中呈阳性反应,与其它立克次体免疫血清反应呈阴性,用该重组蛋白免疫血清做间接免疫荧光,检测立氏立克次体结果为阳性,而检测贝氏柯克斯体、恙虫病立克次体和普氏立克次体的结果为阴性.本研究证明pQE30/ompB转化的大肠杆菌表达了ompB基因片段,所产生的重组蛋白具有立氏立克次体抗原特异性和良好的免疫反应性.
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人野生型MBL基因在大肠杆菌中的表达
为获得人MBL蛋白,并对其功能进行初步研究,用DNA重组法构建了组氨酸标签融合原核表达质粒pET28(b)-MBL.将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG在37℃条件下诱导培养,利用SDS-PAGE、Western-blot检测目的蛋白的表达,用IMAC金属螯合层析柱对其进行纯化.成功地表达了重组MBL蛋白,纯化的MBL浓度约为844μg/mL,为制备MBL的基因工程抗体奠定了基础.
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IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白靶向杀伤白血病细胞的新策略
目的:利用细胞因子-受体的特异性结合来靶向杀伤肿瘤是新一代导向杀伤策略.鉴于白血病细胞异常高地表达IL6/IL6R系统,而正常造血细胞几乎不表达抑或微量表达这一事实,我们率先在国际上开展了利用IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白特异性杀伤高表IL6R白血病新策略的科学性及可行性的探讨.方法:1. IL6-PE40的构建、表达及纯化:常规进行RNA提取、RT-PCR、质粒提取、酶切、回收、连接、转化、鉴定IL6、PE40及IL6-PE40融合基因的序列分析等.将所构建的含IL6-PE40重组质粒在大肠杆菌表达,用HPLC半制备分离其产物,SDS-PAGE及Western-blot鉴定.IL6-PE40的细胞毒活性采用[3H]-亮氨酸掺入U266骨髓瘤细胞检测.
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激血复对防治化疗所致白细胞减少症疗效观察
基因重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF)是一种由大肠杆菌表达的单核巨噬细胞产生的细胞因子,对肿瘤化疗所致的白细胞减少有防治作用[1].本文观察了rhG-CSF对33例患者化疗后白细胞和中性粒细胞下降的防治作用及毒副反应,现将结果报告如下.
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重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性研究
对经大肠杆菌表达的重组人肝再生增强因子进行纯化并观察其对肝损伤小鼠模型的促修复作用。1. 方法:pBV-hALR/JM109工程菌由本室构建,30℃培养至A600=0.6,42℃诱导表达5h,收集不同诱导时间菌体鉴定rhALR的表达水平。包涵体的洗涤变性,复性后经CM-Sepharose FF离子交换柱层析,收集洗脱峰,行SDS-PAGE,结果经UVP labwork扫描处理软件分析测定rhALR纯度,N端氨基酸分析采用手工Edman降解法。
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HCV核心蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学特性研究
目的研究HCV核心蛋白在大肠杆菌中的非融合表达及重组蛋白的免疫学特性.方法用DNA重组技术在两种表达质粒(pQE3O和pTrcHisA)、4种宿主菌(DH5a, TOP10, BL21和M15)中表达HCV全长及羧基端部分缺失的核心蛋白(aa1~191,aa1~154和aa1~69),表达蛋白经SDS-PAGE检测,免疫印迹分析,亲和层析法纯化后免疫BALB/C小鼠,ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HCV抗体水平.结果 HCV核心蛋白C154, C191在pQE30/M15中获得了表达,表达量分别占菌体总蛋白的18.2%和9.3%.免疫印迹分析的结果显示在C154和C191相应位置处出现杂交条带.ELISA结果显示C154和C191诱导小鼠产生了抗HCV 抗体.结论表达的重组蛋白具有抗原特异性和免疫原性.“截断”型HCV核心蛋白的抗原性和免疫原性并未因羧端的部分缺失而减弱.
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人CD7胞外区基因在大肠杆菌中的表达
目的 在大肠杆菌中表达人白细胞分化抗原CD7胞外区蛋白。方法 采用PCR技术调整CD7基因的阅读框架,使之与生物素化蛋白基因阅读框架一致,缺失了CD7 cDNA基因的起始密码子并增加一个大肠杆菌偏性终止密码子,构建CD7胞外区cDNA和生物素化蛋白基因融合的原核表达质粒PinPointxa3-CD7。将重组质粒转入大肠杆菌DH5α表达, SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果。结果 融合蛋白的分子量约为30 000 u,Western blotting结果表明:表达的蛋白质可被抗CD7的单克隆抗体识别。结论 为研制抗CD7基因工程抗体奠定了基础。