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聚合酶链反应改良技术及其用途
80年代中期出现了一种新技术,称为聚合酶链反应(Polymerase chain reation,PCR),其基本原理是在目的基因的两端人工合成两段寡核苷酸引物,在提取于水生嗜热菌中的DNA聚合酶TaqI作用下,以溶液中4种脱氧核苷酸为原料,以待测的目的基因为模板,在人工控制的变性温度、复性温度及延伸温度条件下,于短期内完成目的基因的体外扩增。PCR技术诞生之初基本的用途之一是基因诊断。近随着分子生物学及分子遗传学的进步,针对PCR系统中模板取材、引物设计的改良及PCR产物的不同运用,PCR技术及其用途被多层面、全方位地发展了,从而也显示了PCR技术在生命科学不同领域中运用的强大功能。本文首先就普通PCR技术在各环节的革新方式作一简介,再例举不同PCR改良技术在各研究领域的运用。1 针对PCR技术各环节的革新措施1.1 引物的改良 引物的设计和选择是PCR技术的重要部分,直接关系到PCR的敏感性和特异性,通常需要了解基因背景信息而设计合成引物。随着所合成引物可裁信息量的增加,引物的职能也在不断增加,除了引导脱氧核糖核酸按模板限定聚合外,还可制造出特定的结构以便PCR产物进一步用于基因片段克隆及或基因突变位点的鉴定。如对裂殖子表面蛋白1的17区基因片段(MSP1-17)的PCR扩增,其引物设计时,在正向引物上设计有SalⅠ限制性内切酶位点及起始码,反向引物上设计有BamHⅠ限制性内切酶位点及终止码,由这对引物引导合成的DNA片段属于MSP-17基因,经SalⅠ和BamHⅠ双酶切后的回收片段能与被同样双限制性内切酶切的puc18质粒载体重组[1]。此处的引物的所含的4个功能序列为终得到MSP1-17基因片段的克隆提供了便利。又如,对恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(DHFR)基因进行多态研究时,所用PCR引物F/3′末端以个别碱基替换的机制生成了DraⅠ限制性内切酶位点,通过相应限制性内切酶切后能灵敏地检测出该164号密码子为编码异亮氨基酸多态[2]。又如,为了能直接从PCR扩增产物的指纹图鉴定恶性疟原虫多药抗性基因(Pfmdr1)片段的多态性,使DCW3引物3′末端的碱基以替换方式产生TAT序列,带该3′末端序列的引物只能扩增可与该引物产生全面互补、且含酪氨酸编码序列多态的Pmdr1基因,从而对PCR产物的电泳分析就能鉴别酪氨酸编码的存在[3]。另外,在PCR引物末端带上某种配体,以便PCR通过配体结合机制与别的系统联结,如扩增恶性疟原虫SSUrRNA基因序列中疟原虫种特异保守序列的引物5′末端结合有生物素,带有生物素的PCR产物与包被在聚乙氯烯板上的亲和素结合,结合体可在荧光素标记的寡核苷酸探针介导下与ELISA系统相接[4]。这种对引物的改良所建立的有PCR参予的系统其敏感性、特异性均高于一般PCR。
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恶性疟原虫裂殖子表面蛋白等位基因分型研究进展
疟疾是全球5大公共卫生问题之一,其中以恶性疟的危害更大.恶性疟原虫裂殖子表面蛋白与其入侵有关,是疟疾疫苗的重要候选抗原,恶性疟原虫裂殖子表面蛋白等位基因分型是当前研究的热点.本文对恶性疟裂殖子表面蛋白1,2等位基因研究进展作一综述.
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大肠埃希菌中疟原虫MSP1-17编码基因蛋白重组及表达
目的 为免疫原性及疟疾特异性早期诊断研究,以及高效抗红内期疟原虫复合多价基因疫苗的研究提供基础.方法 (1)以鼠约氏疟原虫MSP1编码基因为模板,片段自4855到5271共416 bp,扩增出pyMSP1 DNA片段,将该片段克隆入质粒pPGEX-2T,构建含有GST编码的质粒pGEX-2T-PyMSP1-17.(2)用上述构建的质粒植入大肠埃希菌DH-5α表达重组蛋白.结果 (1)构建出约氏疟原虫裂殖子表面蛋白1融合基因片段真核重组表达质粒.(2)获得MSP1-GST融合蛋白,在大肠埃希菌DH-5α收获到重组的约氏疟原虫裂殖子表面蛋白浓度为46 mg/L.(3)原核表达的蛋白产物免疫小鼠后分离血清,采用间接免疫荧光法(IFA)检测疟原虫,滴度在1∶400~1∶1000之间均可识别IFA血片中的疟原虫.结论 设计重组MSP1-17基因在大肠埃希菌中真核系统内能够得到充分表达,并具有免疫原性和抗原性.无论是作为DNA疫苗研究的候选者抑或是制备特异性抗体进行疟疾早期诊断都具有重要的意义;由于该抗原的表达量高、免疫原性强,是目前很有希望的疟疾疫苗候选抗原之一.
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126 酵母与大肠杆菌表达的重组裂殖子表面蛋白4/5抗约氏疟原虫致死性攻击保护效果的比较
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疫苗预防疟疾(血液期)
背景:由于疟疾的死亡率和发病率负荷沉重,因此,需要疟疾疫苗.本评价描述血液(无性)期疫苗试验结果.有几种疫苗正在研发中,其中仅裂殖子表面蛋白(MSP)/环状体感染红细胞表面抗原(RESA)疫苗已进行随机对照试验.
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疟原虫入侵红细胞的相关分子及其机制
疟原虫入侵宿主红细胞具有高度的种特异性,这些特异性的分子基础是疟原虫蛋白质与宿主红细胞表面蛋白质的相互作用.寻找参与疟原虫入侵红细胞的相关分子及其入侵机制是疟疾研究领域的热点.针对疟原虫不同种和虫株的实验研究并结合生物信息学分析结果表明:裂殖子表面蛋白、网织红细胞结合蛋白家族、红细胞结合蛋白家族以及动力蛋白等是参与疟原虫入侵红细胞的重要蛋白.该文对这方面的研究进展作了系统的综述,并阐述这些蛋白质在疟原虫入侵过程不同阶段中的作用.
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间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(PvMSP-1)基因多态性研究进展
本文介绍了间日疟原虫裂殖子表面蛋白-1(PvMSP-1)分子结构、基因多态性特征研究进展,着重分析了PvMSP-1作为重要分子标志应用于间日疟原虫基因分型研究、分子流行病学调查、传染源追踪以及遗传学研究等领域的前景和意义.
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恶性疟原虫裂殖子表面蛋白疟疾疫苗的研究进展
疟疾是一种危害严重的虫媒传染病,在疟原虫对抗疟药物的耐药性及媒介蚊对杀虫剂耐药性日益增强的今天,寻求一种新型、高效、安全的抗疟途径-抗疟疾疫苗的研制备受科研人员的关注.本文对恶性疟原虫裂殖子表面蛋白抗疟疾疫苗的研究进展作一概述.
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081恶性疟原虫裂殖子表面蛋白MSP2期特异性反义转录
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009重组约氏疟原虫裂殖子表面蛋白 4/5对小鼠致死性攻击的免疫保护
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051 自然感染恶性疟原虫母婴体内抗裂殖子表面蛋白-1 19 kDa IgG:随年龄增长的亚类分析、无性期原虫血症及保护作用
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表达疟原虫裂殖子表面蛋白1减毒鼠伤寒杆菌的稳定性
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恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2融合HBS 基因重组质粒的免疫原性研究
目的构建恶性疟原虫海南分离株(FCC1/HN)裂殖子表面蛋白2(MSP2)融合HBsAg基因片断真核重组表达质粒pVXORF1-PfMSP2-HBS,观察该DNA疫苗的免疫特性.方法(1)以恶性疟原虫海南分离株(FCC1/HN)基因组为模板,扩增出pfMSP2 DNA片断,将该片段克隆入质粒pVXORF1-HBS中HBS的上游并与之紧密相连,构建质粒pVXORF1-PfMSP2-HBS;构建真核重组表达质粒pVXORF1-PfMSP2以作为对照.(2)用上述构建的质粒及空质粒pVXORF1免疫KM小鼠,以ELISA检测血清IgG抗体.结果(1)筛选出的重组子为编码FCC1/HN MSP2基因片断的重组质粒pVXORF1-PfMSP2-HBS及pVXORF1-PfMSP2.(2)裸DNA尾根多点注射KM小鼠,显示pVXORF1-PfMSP2-HBS组小鼠较pVXORF1-PfMSP2组小鼠产生抗PfMSP2蛋白的抗体效价明显增高,二者比较,差异有非常显著意义(P<0.01).结论PfMSP2融合HBsAg基因片段激发机体产生抗PfMSP2抗体的能力显著增强,提示PfMSP2融合HBsAg基因有可能作为高效抗红内期恶性疟原虫复合多价基因疫苗的有效组成部分.
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海南省消除疟疾后期间日疟原虫裂殖子表面蛋白1基因(MSP-1)多态性检测
目的 比对海南省在消除疟疾前期间日疟原虫裂殖子表面蛋白1的基因型.方法 采用PCR扩增特异性目的 片段,基因测序,序列比对及进化树构建.结果 从27个本地感染间日疟样本分析来看,Sal-1型有24个,分别属于9个Sal-1亚型,为优势型.Belem 型有2个,同属于1个Belem型,重组型的有1个.在各亚型中大多数仍以个别氨基酸间的替换为主,但仍发现2例新亚型以连续的氨基酸(DKKLLKEYELNADEKTKINQN)叠加个别氨基酸替换,另发现1例新型的重组型亚型.Belem型以常见19个多聚谷氨酰胺型.进化树分析可以看出,间日疟Sal-1型与Belem型及重组型可以较好的区分开,属于不同进化簇.Sal-a和Sal-b与其他亚型差距较大,独成一类,而其余亚型相对聚集性一类.Belem型本次调查中虽有2例但同属于同一亚型,为常见20个谷氨酰胺的重复,从进化树得知,该型与其他亚型同属于常见Belem型.重组型仅有一个亚型,属于为II/Q/S型重组型,但该重组型在基因库中未发现同源序列,可能属于新型的重组亚型,有待于进一步研究.结论 海南消除疟疾后期(2009-2012)间日疟仍以Sal-1型为主,但仍存在该等位基因的多样性而非单一性.
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恶性疟BCG多价疫苗及DNA疫苗的实验研制
本项目在恶性疟疫苗候选分子裂殖子表面蛋白-2(MSA2)及环子孢子蛋白(CSP)的分子生物学特征和免疫原性研究的基础上,构建了CSP、MSA2之DNA疫苗,同时率先在国内外构建CSP、MSA2之重组BCG活疫苗,并对疫苗的免疫保护机制、免疫应答及疫苗安全性进行了研究.
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恶性疟原虫裂殖子嵌合性表面蛋白疫苗诱导其高滴度生长抑制抗体
恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的C端19000区( Pf MSP119)是保护性抗体的标靶,但是,一个主要的血期候选疫苗pf MSP142其中包含了Pf MSP119的保护性表位,临床试验表明它的免疫原性和效力不是佳的。根据用约氏疟原虫小鼠模型所作的概念验证研究,作者将重组的 Pf MSP119( rPf MSP119)与恶性疟原虫裂殖子缺失了其低复杂性的Asn/Asp富集区的表面蛋白8, rPf MSP8(△Asn/Asp)的N-端融合制造了一种嵌合性疫苗抗原。用这种嵌合性rPf MSP1/8疫苗免疫小鼠,诱导了与rPf MSP8(△Asn/Asp)相融合者有关的保守表位的强T细胞应答,这种T细胞应答既是Pf MSP8特异的,又能足以帮助生产高滴度的 Pf MSP119和 rPf MSP8(△Asn/Asp)两种组分的抗体。这种情况发生于有佐剂Quil A或MontanideISA720加CpG寡去氧核苷酸( ODN)配方的情况下,并在近交系和远交系小鼠中都能见到。 Pf MSP1/8诱导的抗体与Pf MSP119的两个主要等位片段( FVO和3D7)有很强的反应。特别有意义的是, Pf MSP1/8诱导的 Pf MSP119特异性抗体的滴度高于 rPf MSP142和 rPf MSP8(△Asn/△Asp)的联合配方。就其功能性而言,兔Pf MSP1/8特异性IgG在体外有效地抑制了血期恶性疟原虫FVO和3 D7株的生长。这些数据支持有必要进一步试验和评估嵌合性Pf MSP1/8这一抗原作为恶性疟疾多价疫苗的组分。