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应用抑制性消减杂交技术筛选rhALR调节基因
目的:筛选与克隆重组人肝再生增强因子激活基因,了解其在体内的调节功能线索及机制.方法:应用大肠杆菌系统,表达、纯化重组人肝再生增强因子蛋白.刺激HepG2细胞,以溶剂PH7.8的磷酸盐缓冲液为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建重组人肝再生增强因子激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到30个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得19种编码基因,包括15种已知基因和4种未知基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因,推测了重组人肝再生增强因子在体内可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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重组人肝再生增强因子对小鼠CCl4中毒性肝损伤的治疗作用
目的:利用大肠杆菌的基因工程技术,制备重组的人肝再生增强因子(ALR)药物,对于CCl4肝损伤的小鼠模型进行治疗,评价重组的人肝再生增强因子在肝损伤治疗中的效果和价值.方法:应用大肠杆菌系统,表达、纯化重组人肝再生增强因子蛋白.利用四氯化碳法制备肝细胞损伤的动物模型,以重组的人肝再生增强因子药物进行治疗,以生理盐水治疗作为对照,比较治疗后血清ALT,AST水平的变化,评价重组的人肝再生增强因子对于肝损伤的治疗作用.结果:成功制备了重组的人肝再生增强因子药物,纯度在98%以上.成功制备了四氯化碳的小鼠肝损伤模型,经过重组的人肝再生增强因子药物治疗后,血清中ALT,AST水平都有显著的下降(ALT:991 U/L对2 134 U/L,P＜0.01;AST:938 U/L对1873 U/L,P＜0.01).结论:重组的人肝再生增强因子药物,有希望成为各种原因引起的肝细胞损伤的治疗药物.
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重组人肝再生增强因子对肝纤维化大鼠基质分解素-1基因表达的影响
为了解重组人肝再生增强因子（hALR）对肝纤维化大鼠基质分解素-1(MMP3)基因表达的影响，建立CCl4中毒性及人血白蛋白免疫损伤性两种大鼠肝纤维化模型，模型完成后予不同剂量hALR治疗，在不同的时间点留取大鼠肝组织标本，提取总RNA，用逆转录定量聚合酶链反应（RT-PCR）测定MMP3的基因表达水平。结果在两种模型中hALR治疗组大鼠肝组织MMP3的基因表达水平在治疗过程中的不同阶段均明显高于模型组；高剂量hALR组大鼠肝组织基质分解素-1的基因表达水平均明显高于低剂量组。提示hALR可增强肝纤维化大鼠MMP3的基因表达。
关键词： 重组人肝再生增强因子 基质分解素-1 基因表达 -
重组人肝再生增强因子可抑制肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的基因表达
在培养的肝星状细胞系中加入不同浓度的重组人肝再生增强因子(hALR),于不同的时间点收集细胞,提取总RNA,用逆转录定量PCR方法测定Ⅰ、Ⅲ型胶原的基因表达水平.结果表明,高(0.2ng/L)、中(0.02 ng/L)、低(0.002ng/L)浓度的hALR 3组肝星状细胞Ⅰ型胶原基因表达水平在8、24、48、72h 4个时间点均明显低于对照组;大剂量组较中、低剂量组Ⅰ型胶原基因表达水平亦明显为低.中、低剂量hALR组肝星状细胞Ⅲ型胶原基因表达水平在24、48、72h 3个时间点明显低于对照组;大剂量hALR组肝星状细胞Ⅲ型胶原基因表达水平在8、24、48、72h 4个时间点均明显低于对照组,较中、小剂量组亦显著降低. 提示重组人肝再生增强因子对肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达有明显的抑制作用.
关键词： 重组人肝再生增强因子 肝星状细胞 Ⅰ、Ⅲ型胶原 基因表达 -
重组人肝再生增强因子对实验性肝纤维化血清透明质酸浓度的影响
为了解重组人肝再生增强因子(hALR)对大鼠实验性肝纤维化形成过程中血清透明质酸浓度的影响,建立了四氯化碳中毒性及人血白蛋白免疫损伤性两种大鼠肝纤维化模型.在造模的同时给予不同剂量hALR治疗,并在不同的时间点留取大鼠血清标本,测定透明质酸浓度.结果表明,在两种模型中hALR两组大鼠血清透明质酸浓度在造模过程中的不同阶段均明显低于模型组.高剂量hALR组大鼠血清透明质酸浓度均明显低于低剂量组.上述结果提示,重组人肝再生增强因子可降低实验性肝纤维化大鼠血清透明质酸含量.
关键词： 肝硬化 透明质酸 重组人肝再生增强因子 -
重组人肝再生增强因子对肝星状细胞基质分解素-1及其抑制因子基因表达的调节
肝再生增强因子(ALR)是Hagiya等[1]1994年从新生大鼠肝组织中克隆的一种理化性质与肝刺激物( HSS)相似的促肝细胞增殖因子.新近,我国学者克隆了大鼠ALR的人类同源分子[2],并通过构建原核表达载体,获高效表达菌株,进而获得重组hALR.初步研究表明hALR对四氯化碳中毒性及①免疫损伤性大鼠肝纤维化均有明显的防治作用[3、4].本文拟通过观察hALR对肝星状细胞基质分解素-1( MMP3 )及金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP1) 基因表达的影响,从细胞外基质降解代谢的角度探讨hALR抗肝纤维化的机制.
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重组人肝再生增强因子对肝纤维化大鼠金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达的影响
目的了解重组人肝再生增强因子(hALR)对实验性肝纤维化大鼠肝组织金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP1)基因表达的影响.方法我们建立了四氯化碳中毒性及人血白蛋白免疫损伤性两种大鼠肝纤维化模型,在造模的同时给予不同剂量的hALR.在不同的时间点留取大鼠肝组织标本,提取总RNA,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定TIMP1的基因表达水平.结果在两种模型中大鼠肝组织TIMP1的基因表达水平在模型形成过程中逐渐升高;低剂量hALR组大鼠肝组织TIMP1的基因表达水平与模型组及阴性对照组差异无显著意义;高剂量hALR组大鼠肝组织TIMP1的基因表达水平(四氯化碳模型第2、4、6、8周分别为0.63±0.10、1.18±0.20、1.89±0.30、2.63±0.33;人血白蛋白模型尾静脉攻击中、攻击后分别为2.33±0.36、4.02±0.53)均明显低于模型组(四氯化碳模型第2、4、6、8周分别为0.99±0.14、2.03±0.30、2.99±0.43、4.13±0.44;人血白蛋白模型尾静脉攻击中、攻击后分别为4.13±0.60、5.99±0.83)及阴性对照组.结论大剂量hALR可能有抑制实验性肝纤维化大鼠肝组织TIMP1基因表达的作用.
关键词： 重组人肝再生增强因子 金属蛋白酶组织抑制因子-1 基因表达 -
重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性分析
目的 对在大肠杆菌中表达的重组人肝再生增强因子(rhALR)进行分离纯化及生物学活性分析.方法 以大肠杆菌DH5α发酵表达重组人肝再生增强因子,经包涵体洗涤、变性、目的蛋白复性,以离子交换、分子筛等技术纯化,并进行一系列检定.结果 目的 蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性及柱层析纯化,纯度大于98%,SDS-PAGE测定相对分子质量为30 000,MOLDI-TOF-MS测定其相对分子质量为30 780.522,N-末端15个氨基酸与理论序列一致.Western blot证实rhALR正确表达,等电点5.85～6.85,氨基酸含量与理论值基本符合.动物实验证实rhALR具有明显的促进CCl4毒性肝损伤小鼠肝细胞修复活性.结论 经柱层析纯化的rhALR具有促进小鼠CCl4肝损伤肝细胞修复的活性.
关键词： 重组人肝再生增强因子 层析 生物活性 -
重组人肝再生增强因子对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体DNA的保护作用
目的:初步探讨重组人肝再生增强因子(rhALR)保护及改善梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体功能及肝功能的机制.方法:144只健康wistar大鼠随机分为SHAM组,BDO-RBF组,BDO-RBF-rhALR组,利用荧光定量PCR方法,对各组大鼠肝细胞总mtDNA、缺失型mtDNA进行相对定量检测.结果:胆道梗阻后,肝细胞线粒体总mtDNA拷贝数出现明显下降(P<0.01).BDO-RBF-rhALR组总mtDNA拷贝数下降程度明显低于BDO-RBF组(P<0.05);对于缺失型mtDNA占总mtDNA的百分比,在SHAM组,未检测出缺失型mtDNA,而在BDO-RBF组及BDO-RBF-rhALR组,均可见缺失型mtDNA,BDO-RBF组的缺失型mtDNA占总mtD-NA的百分比明显高于BDO-RBF-rhALR组(P<0.05);在胆道梗阻解除后,BDO-RBF-rhALR组的总mtDNA的拷贝数及缺失型mtDNA修复速度明显快于BDO-RBF组(P<0.05).结论:rhALR可通过保护及修复梗阻性黄疸大鼠肝细胞受损的mtDNA,达到保护及改善梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体功能及肝功能的目的.
关键词： 重组人肝再生增强因子 梗阻性黄疸 线粒体 DNA -
重组人肝再生增强因子可促进实验性肝纤维化基质分解素-1的基因表达
目的了解重组人肝再生增强因子(hALR)对实验性肝纤维化基质分解素-1(MMP3)基因表达的影响.方法建立四氯化碳(CCl4)中毒性及人血白蛋白免疫损伤性两种大鼠肝纤维化模型,在造模的同时给予不同剂量的重组hALR.在不同的时间点留取大鼠肝组织标本,提取总RNA,用RT-PCR测定MMR的基因表达水平.结果在两种模型中,hALR治疗组大鼠肝组织MMP3的基因表达水平在模型形成的不同阶段均明显高于模型组;高剂量hALR组大鼠肝组织MMP3的基因表达水平均明显高于低剂量组.结论重组hALR可能有促进大鼠实验性肝纤维化MMP3基因表达的作用.
关键词： 重组人肝再生增强因子 基质分解素-1 基因表达 -
重组人肝再生增强因子抑制实验性肝纤维化明胶酶A基因表达
目的了解重组人肝再生增强因子(hALR)对实验性肝纤维化明胶酶A(MMP2)基因表达的影响.方法建立CCl4中毒性及人血白蛋白免疫损伤性两种大鼠肝纤维化模型,在造模的同时给予不同剂量(10,50μg@kg-1@d-1)的hALR.在不同的时间点留取大鼠肝组织标本,提取总RNA,用逆转录定量聚合酶链反应(RT-PCR)测定MMP2的基因表达水平.结果在两种模型中两个剂量hALR预防组大鼠肝组织MMP2的基因表达水平在模型形成的不同阶段均明显低于模型组;高剂量hALR组大鼠肝组织MMP2的基因表达水平均明显低于低剂量组.结论重组人肝再生增强因子可能有抑制大鼠实验性肝纤维化MMP2基因表达的作用.
关键词： 重组人肝再生增强因子 明胶酶A 基因表达 -
腹腔注射重组人肝再生增强因子促进梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体转录因子A及核呼吸因子1的表达
目的:观察重组人肝再生增强因子(recombinant human augmenter of liver regeneration,rhALR)对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)及核呼吸因子1(nuclear respiratory factor-1,NRF-1)表达的影响.方法:健康Wistar大鼠随机分为假手术(Sham)组、胆道梗阻再通(BDO-RBF)组、胆道梗阻再通及rhALR治疗(BDO-RBF-rhALR)组(n=48),利用荧光定量PCR方法检测各组大鼠肝细胞TFAM、NRF-1 mRNA的表达.结果:当胆道梗阻后,大鼠肝细胞TFAM、NRF-1 mRNA表达均下降(P<0.05),且随着梗阻时间的延长其下降程度逐步增加;解除梗阻后,其拷贝数逐步恢复.BDO-RBF-rhALR组大鼠TFAM、NRF-1 mRNA表达明显高于同一时间点BDO-RBF组(P<0.05).结论:腹腔注射rhALR可能通过促进梗阻性黄疸大鼠肝细胞TFAM、NRF-1 mRNA表达发挥保护肝功能的作用.
关键词： 重组人肝再生增强因子 梗阻性黄疸 TFAM NRF-1 -
重组人肝再生增强因子对5/6肾切除大鼠肾组织MMP-9、 TIMP-1及Collgen-Ⅳ表达的影响
目的 探讨重组人肝再生增强因子(rhALR)是否可以通过影响基质金属蛋白酶9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1( TIMP-1)及Ⅳ型胶原(Collgen-Ⅳ)的表达,来延缓肾小球硬化.方法 雄性SD大鼠分为假手术组、对照组及rhALR组,以rhALR对5/6肾切除所致慢性肾衰竭大鼠进行干预.结果 与假手术组比较,对照组肾小球硬化指数增大,Collgen-Ⅳ、TIMP-1表达增加,MMP-9表达减少(P均＜0.05)；外源性给予rhALR能降低TIMP-1表达,增加MMP-9表达,减轻Collgen-Ⅳ的沉积,改善肾小球硬化(P均＜0.05).结论 rhALR可通过上调MMP-9/TIMP-1比例减少Collgen-Ⅳ积聚而改善肾小球硬化,保护残肾功能.
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重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性研究
对经大肠杆菌表达的重组人肝再生增强因子进行纯化并观察其对肝损伤小鼠模型的促修复作用。1. 方法：pBV-hALR/JM109工程菌由本室构建，30℃培养至A600＝0.6，42℃诱导表达5h，收集不同诱导时间菌体鉴定rhALR的表达水平。包涵体的洗涤变性，复性后经CM-Sepharose FF离子交换柱层析，收集洗脱峰，行SDS-PAGE，结果经UVP labwork扫描处理软件分析测定rhALR纯度，N端氨基酸分析采用手工Edman降解法。
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线粒体转录因子A对梗阻性黄疸大鼠肝功能的保护作用
目的 初步探讨线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)在重组人肝再生增强因子(rhALR)对梗阻性黄疸大鼠肝功能保护过程中的作用.方法 首先体外合成靶向TFAM的有效慢病毒载体,然后建立梗阻性黄疸大鼠动物模型,并通过门静脉将慢病毒注入大鼠肝组织进行靶向TFAM活体RNA干扰实验.然后通过RT-PCR和Western blot检测目的 基凶表达量的改变并观察大鼠肝脏病理改变、肝脏功能改变及rhALR保护作用的变化情况.结果 体外靶向TFAM慢病毒载体构建成功.通过门静脉注入后能特异、有效的感染肝组织细胞.RT-PCR和Western blot检测结果 显示进行活体RNAi的大鼠肝组织中TFAM的表达明显减弱;且这一组大鼠肝脏病理改变为明显,肝功能损害严重.rhALR的肝功能保护作用也随着消失.结论 阻断目的 基因TFAM的表达使得rhALR对梗阻性黄疸大鼠肝功能的保护作用消失;TFAM在rhALR保护梗阻性黄疸大鼠肝功能过程中具有重要作用.
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重组人肝再生增强因子对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体功能的保护作用
目的 探讨重组人肝再生增强因子(rhALR)对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体功能及肝功能的保护作用.方法 144只健康Wistar大鼠随机分为SHAM组、BDO-RBF组、BDO-RBF-rhALR组,分别检测其线粒体功能及肝功能的变化情况,电镜观察各组大鼠肝细胞线粒体的形态学改变.结果 胆道梗阻后,大鼠线粒体功能及肝功能均出现明显损伤(P＜0.05或P＜0.01),BDO-RBF-rhALR组肝细胞线粒体功能及肝功能的损害程度明显轻于BDO-RBF组(P＜0.05),并且当胆管再通后,其恢复更快.电镜观察梗阻性黄疸后,肝细胞线粒体出现明显损伤,BDO-RBF-rhALR组病理改变明显轻于BDO-RBF组.结论 rhALR对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体功能及肝功能具有明显的保护作用.
关键词： 重组人肝再生增强因子 线粒体功能 梗阻性黄疸 大鼠
